金磁微粒介導的抗六聚組氨酸多克隆抗體的純化

李淑娟, 牛育鴻

(延安大學西安創(chuàng)新學院， 陜西 西安 710100)

0 前言

六聚組氨酸是一種融合蛋白純化和檢測的常用標簽[1-3]， Ni2+螯合樹脂已被廣泛用于六聚組氨酸融合蛋白純化[4].然而，由于免疫親和純化和檢測的高選擇性，通過抗6×His抗體純化和檢測六聚組氨酸融合蛋白的方法受到很大關注，目前已有商品化的特異性針對6×His的單克隆抗體，但價格都比較昂貴.

金磁微粒是一種新型磁性復合微粒[5], 具有超順磁性的金磁微粒，含有Fe3O4的核以及金的殼層, 該材料集膠體金對生物分子的快速固定化和磁性顆粒在外磁場中的可分離性能于一體, 在免疫學研究領域顯示了巨大的優(yōu)勢.目前，高分子包覆的磁性微粒表面固定蛋白質或抗體已被用于親和層析研究[6], 但將磁性復合微粒用于小分子融合標簽的多克隆抗體制備中載體蛋白抗體去除的研究未見報道.為此，本實驗制備了六聚組氨酸多克隆抗體，利用表面固定有KLH的金磁微粒對多克隆抗體中抗載體蛋白KLH抗體進行去除，得到了高純度的抗小分子6×His的抗體，為研究6×His融合蛋白純化檢測奠定了基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

動物: 新西蘭兔，購于西安交通大學醫(yī)學院，六聚組氨酸(6×Histidine, 6×His)由西安華辰生物科技有限公司合成，匙孔血藍蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH)購自德國MERCK公司，牛血清白蛋白(BSA)、HRP標記的羊抗兔二抗、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑等均購自北京鼎國生物技術有限責任公司，1-(3-二甲氨基丙基)-3-亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)購自美國PIERCE公司，2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)購自美國Sigma公司，金磁微粒(5 mg /mL)購自陜西北美基因股份有限公司.

1.2 方法

1.2.1 抗原的合成

采用EDC法[7]制備偶聯(lián)物6×His-KLH和6×His-BSA，分別作為免疫原和包被抗原.合成過程為：取2 mg的KLH (BSA)溶于200 μL偶聯(lián)緩沖液(含0.9 mol/L NaCl的 0.1 mol/L MES，pH 4.5～5)中，接著取2 mg的6×His溶于500 μL偶聯(lián)緩沖液中，然后將兩者混合，在混合液中迅速加入10 mg/mL的EDC 100 μL (偶聯(lián)BSA和6×His時，加入10 mg /mL的EDC 50 μL)，室溫反應2 h.

1.2.2 動物免疫

取500 μg 6×His-KLH用生理鹽水稀釋至0.2 mL，與等體積完全弗氏佐劑混合，于兔頸部皮下多點注射；兩周后改用不完全弗氏佐劑進行加強免疫，劑量同前；此后每隔3周加強免疫一次，并于加強免疫后10～12 d從兔耳緣靜脈抽血測定其效價，達到要求后，心臟采血收集抗血清.

1.2.3 抗六聚組氨酸多克隆抗體效價測定

抗血清經(jīng)飽和硫酸銨沉淀法初步純化后，以6×His-BSA和KLH分別作為包被抗原，采用間接EL ISA法測定效價[8].

1.2.4 金磁微粒介導的多克隆抗體中抗載體蛋白KLH抗體的去除

1.2.4.1 金磁微粒表面KLH的固定化容量測定

取200 μL (5 mg/mL)金磁微粒九等份，經(jīng)預處理，分別與1 mg/mL KLH溶液100、200、300、400、500、600、700、1 000、2 000 μL混合，置搖床室溫反應30 min，在280 nm處測定KLH固定前后的吸光度值，則KLH的固定化效率可表示為：OD280固定前-OD280固定后/OD280固定前.通過上述公式計算KLH的固定化效率，再乘以KLH加入質量，得到其固定化容量.

1.2.4.2 金磁微粒-KLH與多克隆抗體最佳結合比例的確定

取固定有KLH的金磁微粒，分別按KLH與多克隆抗體的質量比為50∶3、50∶6、50∶11、50∶16的比例加入初步純化的多克隆抗體，置搖床室溫反應30 min，磁性分離，收集上清液.用間接ELISA法測定反應前后多克隆抗體中抗KLH抗體的效價，確定多克隆抗體中抗KLH抗體完全去除時金磁微粒-KLH與多克隆抗體的最佳比例.

1.2.4.3 金磁微粒-KLH去除抗KLH抗體效果的檢測

按上述確定的最佳比例對多克隆抗體中抗KLH抗體進行去除，并利用間接ELISA法分別測定去除前后抗KLH抗體和抗6×His抗體的效價，以檢測金磁微粒的去除效果.

2 結果與討論

2.1 多克隆抗體的效價測定

表1 抗6×His多克隆抗體效價測定

選用BSA-6×His偶聯(lián)物包被酶標板測定抗6×His抗體效價，KLH包被酶標板測定抗KLH抗體的效價.由表1可見，產(chǎn)生的多克隆抗體是針對KLH-6×His偶聯(lián)物的特異性抗體，抗6×His抗體效價大于20 000.隨著抗體稀釋度的增加，以BSA-6×His為包被抗原的陽性值明顯下降，而以KLH為包被抗原的陽性值無明顯變化，說明抗體中含有大量的抗KLH抗體，上述抗血清經(jīng)飽和硫酸銨沉淀法初步純化后只能去除抗血清中的白蛋白等組分，抗6×His和KLH的抗體依然共存.

2.2 金磁微粒介導的多克隆抗體中抗載體蛋白KLH抗體的去除

2.2.1 金磁微粒表面KLH的最大固定化量

取1 mg的金磁微粒，通過對一系列不同質量的KLH進行固定，計算得1 mg金磁微粒表面最多可固定KLH量為700 μg.

2.2.2 金磁微粒-KLH和多克隆抗體最佳結合比例的確定

固定化KLH量與待去除抗體的量達到一定比例時，才能保證多克隆抗體中抗KLH抗體較完全地與金磁微粒表面的KLH發(fā)生免疫反應而被去除.本研究對金磁微粒-KLH和多克隆抗體的最佳結合比例進行了探討，結果如圖1所示.由圖1可知，當金磁微粒-KLH與多克隆抗體的質量比為50∶3、50∶6、50∶11、50∶16時，去除前后抗KLH抗體效價都大幅度下降，但是比例為50∶3時下降幅度最大，而且隨著抗體稀釋比例的增大，OD450的值基本保持不變.可見，比例大于50∶3時即可穩(wěn)定地完全地去除多克隆抗體中抗KLH抗體，比例為50∶6、50∶11、50∶16時去除后抗體中仍殘留部分抗KLH抗體，達不到完全去除多克隆抗體中抗KLH抗體的目的.

圖1 KLH-金磁微粒去除多克隆抗體中抗KLH抗體后抗KLH抗體效價測定 圖2 去除前后抗6×His抗體和抗KLH抗體的效價比較

2.2.3 金磁微粒去除抗KLH抗體效果的檢測

在優(yōu)化條件下對多克隆抗體中抗KLH抗體進行去除，并檢測其去除效果，結果如圖2所示.由圖2可知，去除后，KLH抗體效價明顯下降，而6×His抗體效價則無大的變化，表明金磁微粒對抗KLH抗體的去除非常有效.

3 結束語

六聚組氨酸為六肽，相對分子質量較小，單獨作用時不具有免疫原性或抗原性弱，必須與載體蛋白偶聯(lián)后才能產(chǎn)生針對6×His的抗體.在本實驗中選用KLH作為載體蛋白，KLH相對分子質量非常大，為多亞基蛋白質，具有強的免疫原性.然而以6×His和KLH合成的抗原免疫動物，得到的多克隆抗體除含有針對6×His的抗體，還含有大量針對KLH的抗體，這些抗KLH的無關抗體會影響6×His多克隆抗體的應用.基于此，作者利用表面固定有KLH的金磁微粒對多克隆抗體中抗KLH抗體進行去除實驗，得到了高純度的抗小分子6×His的抗體，為研究6×His融合蛋白純化檢測奠定了基礎，同時證明核殼型金磁微?？勺鳛榭贵w親和純化的良好載體，在其表面包被不同蛋白可方便地用于不同抗體的吸收除雜，特別是在小分子藥物多克隆抗體的純化方面具有非常重要的應用前景.

參考文獻

[1] Mathur D, Garg L C. Functional phosphoglucose isomerase from mycobacterium tuberculosis H37Rv: Rapid purification with high yield and purity[J].Protein Expression and Purification, 2007, 52(2): 373-378.

[2] Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems[J]. Applied microbiology and biotechnology, 2003,60(5): 523-533.

[3] Chiang Y W, Wu J C, Wang K C,etal. Efficient expression of histidine-tagged large hepatitis delta antigen in baculovirus-transduced baby hamster kidney cells[J]. World journal of Gastroenterology, 2006, 12(10):1 551-1 557.

[4] 潘 飛,邱雁臨. 還原型谷胱甘肽的金屬螯合親和色譜純化[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2006，37(4)：237-239.

[5] 崔亞麗，慧文利, 汪慧蓉，等. Fe3O4/Au的制備條件及性質研究[J].中國科學：B輯，2003，33(6):482-488.

[6] Ozkara S, Akgol S,Canak Y,etal. A novel magnetic absorbent for immuneoglobulin-G purification in a magnetically stabilized fluidized bed[J].Biotechnol Pro., 2004, 20(11)：69-1 175.

[7] 閔玉濤，王云龍，李晨陽，等. 抗FLAG標簽單克隆抗體的制備、鑒定及初步應用[J]. 中國生物工程雜志，2006,27(1):93-97.

[8] 朱正美. 簡明免疫學技術[M]. 北京: 科學出版社, 2002:200-210.