CGRP受體拮抗劑CGRP8-37對(duì)顱腦創(chuàng)傷后大鼠保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究1)

賈志亮,劉躍亭,段虎斌

創(chuàng)傷性腦損傷引起的腦水腫是神經(jīng)外科需要解決的一大難題。目前的方法都還不能完全克服這個(gè)難題。CGRP作為腦內(nèi)存在的一種強(qiáng)大的擴(kuò)血管物質(zhì),在腦損傷后引起的腦水腫中的具體作用目前研究甚少[1]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化和PCR技術(shù),動(dòng)態(tài)分析CGRP及其拮抗劑在創(chuàng)傷性腦損傷后腦水腫形成這一病理過(guò)程中的作用,為CGRP拮抗劑應(yīng)用于臨床提供相關(guān)依據(jù),同時(shí)為治療創(chuàng)傷后腦水腫提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 雄性Wistar大鼠90只(山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供),體重250 g～300 g,隨機(jī)分為對(duì)照組(6只)、創(chuàng)傷組(TBI組,42只)和CGR98-37,606組(LT組,42只)。然后再按照0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h隨即分為7個(gè)亞組,創(chuàng)傷組和CGRP8-37組每亞組6只,對(duì)照組每亞組1只。

1.2 模型制作 創(chuàng)傷組和CGRP8-37組大鼠所處實(shí)驗(yàn)環(huán)境相同,用20%的烏拉坦腹腔注射(1.2 g/kg)麻醉滿意后,將大鼠固定在腦立體定位儀上。制作TBI組模型時(shí)沿正中線切開頭皮并剝離骨膜,切口長(zhǎng)2 cm,暴露右頂骨,牙科臺(tái)式電鉆(寧波醫(yī)療器械廠)于冠狀縫后1.5 mm,中線右旁2.5mm處鉆一直徑為5mm的圓形骨窗,保持硬腦膜完整,用Feeney法[1]按自由落體致傷原理,通過(guò)撞擊裝置(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器廠),將撞桿頭端置骨窗處,另用擊錘(20 g)沿外周導(dǎo)管從30 cm高處自由落下撞擊撞桿,造成右頂葉腦挫傷,骨蠟封閉骨窗,縫合頭皮。于傷后0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h開顱取腦。CGRP8-37組大鼠造成右頂葉腦挫傷后立即腦室內(nèi)給予CGRP受體拮抗劑CGRP8-37(30 nmol/kg Sigma公司),然后也于0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h開顱取腦。對(duì)照組暴露硬腦膜后不予打擊,直接關(guān)顱,縫合頭皮。

1.3 免疫組化和HE染色

1.3.1 組織標(biāo)本制作 將各組大鼠在相應(yīng)時(shí)間斷頭取腦,在無(wú)菌條件下,依腦組織的損傷中心為標(biāo)準(zhǔn)冠狀位,切開大腦。前半部分大腦,立即浸入4℃10%中性甲醛溶液內(nèi)固定24 h～48 h。后半部分大腦放入-180℃液氮罐中,以備PCR之用。將固定后的腦組織從甲醛溶液內(nèi)取出,以損傷中心為標(biāo)準(zhǔn)冠狀位依向大腦后緣切(4～5)mm腦切片1個(gè),分別進(jìn)行脫水、包埋,制成蠟塊。

1.3.2 蘇木精-伊紅(HE)染色 蘇木素染液染核至藍(lán),1%鹽酸酒精分化,1%氨水返藍(lán),0.1%伊紅染液染細(xì)胞質(zhì),然后脫水、透明、封片。采用M IAS-2000圖像分析系統(tǒng)拍照。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色 采用PV-6001二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)。用0.01 mo l/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0),高壓熱修復(fù)40 s;過(guò)氧化氫孵育;加兔抗大鼠CGRP多克隆抗體(Sigma公司產(chǎn)品)4℃過(guò)夜,使用效價(jià)為1∶5 000。次日加辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體,37℃孵育30m in;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,顯微鏡下控制顯色時(shí)間。采用M IAS-2000圖像分析系統(tǒng),拍照并測(cè)定目標(biāo)面積、視場(chǎng)面積、目標(biāo)平均灰度和視場(chǎng)平均灰度,并通過(guò)以下公式計(jì)算陽(yáng)性單位[PU=｜G 0-GV｜/(1-AAR)GMAX;PU:陽(yáng)性單位,G0:目標(biāo)平均灰度,GV:視場(chǎng)平均灰度,AAR:面積密度比值,GMAX:最大灰度(255)]。

1.4 腦組織CGRPmRNA RT-PCR測(cè)定和數(shù)據(jù)分析 在無(wú)菌條件下,從液氮罐中取出腦組織,按照對(duì)照組、TBI和CGRP8-37組相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)行RT-PCR分析,按Trizol試劑(Invitrogen公司進(jìn)口)說(shuō)明提取組織總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量。采用Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒按操作說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA,產(chǎn)物進(jìn)行PCR。AQP 4引物:上游序列5′-GGGTTGGACCAATCA TAGGCGCT-3′,下游序列5-GCAGGAAATCTGAGGCCAGTTCTAGG-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)330 bp;GAPDH引物:上游序列5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′,下游序列5′-AGATCCACAACGGA TACA-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)303 bp。退火溫度72℃,反應(yīng)36個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),電泳結(jié)束后,將凝膠置于圖像系統(tǒng)處理分析,獲得目的基和GAPDH的吸光度值,以GAPDH的吸光度值作為內(nèi)參照,計(jì)算出目的基因與GAPDH基因之間的比值,作為AQP4 mRNA表達(dá)的水平,引物合成為上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行處理,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用雙因素重復(fù)樣本的方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察 從打擊側(cè)冠狀切面可見:對(duì)照組大鼠在0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h等7個(gè)時(shí)間點(diǎn)腦組織表面光滑,溝回整齊、清晰、無(wú)充血、水腫及出血灶。TBI組腦損傷后0.5 h,皮質(zhì)表面、蛛網(wǎng)膜下腔、挫裂傷灶周圍皮質(zhì)及皮質(zhì)下白質(zhì)均有不同程度出血,略有腫脹。傷后2 h～6 h,蛛網(wǎng)膜下腔出血、皮質(zhì)表面挫裂傷灶,周圍皮質(zhì)及皮質(zhì)下白質(zhì)出血持續(xù)加重。12 h損傷最重,腫脹最明顯。72 h后,出血基本吸收,腫脹有所減輕,但水腫程度仍高于對(duì)照組。CGRP8-37組傷后0.5 h蛛網(wǎng)膜下腔、皮質(zhì)和皮質(zhì)下組織有少量出血,后逐漸加重,2 h出血最多,腫脹最明顯。6 h后出血開始吸收,水腫逐漸消退,72 h時(shí)溝回較整齊、基本無(wú)充血、水腫及出血灶。

2.2 免疫組化結(jié)果 TBI組大鼠傷后0.5 h腦組織CGRP陽(yáng)性單位表達(dá)開始上調(diào),2h、6h依次增高,12h達(dá)到高峰(P＜0.05),CGRP8-37組傷后0.5 h CGRP陽(yáng)性單位表達(dá)也開始上調(diào),隨著時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)持續(xù)升高,2h達(dá)高峰,然后持續(xù)回落,72 h恢復(fù)正常(P＜0.05)。CGRP8-37組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)CGRP陽(yáng)性單位表達(dá)明顯低于TBI組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對(duì)照組,TBI,CGRP8-37組創(chuàng)傷周邊區(qū)CGRP陽(yáng)性單位表達(dá)不同,(F=59 124.926,P＜0.01)。對(duì)照組傷后0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h相互之間CGRP陽(yáng)性單位表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。TBI,CGRP8-37組傷后0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h之間CGRP陽(yáng)性單位總體有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。TBI組6 h和24 h、0.5 h和48 h CGRP陽(yáng)性單位表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。時(shí)間和分組之間有交互效應(yīng)(F=3 589.696,P＜0.01)。

2.3 腦組織CGRPmRNA的表達(dá)及其變化 TBI組大鼠傷后0.5 h腦組織CGRP mRNA表達(dá)開始上調(diào),2 h、6 h依次增高,12 h達(dá)到高峰(P＜0.05),CGRP8-37組傷后CGRP0.5 hm RNA表達(dá)也開始上調(diào),隨著時(shí)間的推移表達(dá)持續(xù)升高,2 h達(dá)高峰,然后持續(xù)回落,72 h恢復(fù)正常(P＜0.05)。CGRP8-37組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)AQP4mRNA表達(dá)明顯低于TBI組(P＜0.05)。對(duì)照,TBI,CGRP8-37組創(chuàng)傷周邊區(qū)CGRP mRNA表達(dá)不同(F=7198.397,P＜0.01)。對(duì)照組傷后0.5h、2h、6h、12 h、24 h、48 h、72 h相互之間CGRP mRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。TBI,CGRP8-37組傷后0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h之間CGRPmRNA總體有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=511.471,P＜0.01)。TBI組6 h和24 h、0.5h和48 h CGRPmRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。時(shí)間和分組之間有交互效應(yīng)(F=229.026,P＜0.01)。

3 討 論

CGRP是由Amana和Rosenfold等應(yīng)用DNA基因重組和分子生物學(xué)技術(shù)于1982年首先發(fā)現(xiàn)的生物活性多肽,由37個(gè)氨基酸殘基組成,分子量是3 786.91。免疫組化顯示,CGRP樣免疫陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞可見于中樞神經(jīng)系統(tǒng)各部,特別是感覺(jué)神經(jīng)元的胞體[2]。

降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitoningene-related pep tide,CGRP)是辣椒素敏感感覺(jué)神經(jīng)中主要的神經(jīng)遞質(zhì),具有強(qiáng)大的血管舒張作用。CGRP具有拮抗內(nèi)皮素(ET)-1的血管收縮效應(yīng)。Nozaki等[3]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)其劑量依賴性,且作用強(qiáng)于SP、血管活性腸肽(V IP)等其他血管擴(kuò)張介質(zhì)[4]。

CGRP作為目前已知最強(qiáng)的內(nèi)源性擴(kuò)血管物質(zhì),其強(qiáng)大的擴(kuò)血管作用能促進(jìn)水腫的形成。具體機(jī)制是CGRP與受體結(jié)合后,激活鳥苷酸環(huán)化酶,促使細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷水平升高,促進(jìn)前列腺素釋放,進(jìn)而血管通透性升高,血漿滲出,水腫形成。同時(shí)CGRP還能抑制P物質(zhì)的降解,促使SP從感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放,有加強(qiáng)SP和其他炎性介質(zhì)形成水腫的作用。CGRP不僅介導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥,還與一些炎性細(xì)胞、免疫細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子有相互作用。CGRP能誘導(dǎo)人單核細(xì)胞合成IL-8等致炎因子,提高其m RNA表達(dá)水平[5]。Yamaguchi等[6]在做相似的研究中也發(fā)現(xiàn)CGRP能促使IL-1、IL-6和TNF-α顯著增加,并成時(shí)間劑量依賴性。

本實(shí)驗(yàn)中,TBI組損傷區(qū)周邊CGRP陽(yáng)性單位在損傷初期即急劇上升,隨著病情的進(jìn)展,CGRP表達(dá)持續(xù)上升,12 h達(dá)高峰,這與損傷后痛覺(jué)神經(jīng)末梢纖維致敏,釋放大量CGRP有關(guān)。隨后CGRP的表達(dá)回落,24 h,48 h,72 h持續(xù)下降,推測(cè)這是由于機(jī)體自身復(fù)雜機(jī)制的調(diào)節(jié),如痛覺(jué)的逐漸適應(yīng)和減輕,機(jī)體的免疫調(diào)節(jié),以及機(jī)體內(nèi)縮血管物質(zhì)所致的拮抗作用。與TBI組相比,CGRP8-37組CGRP表達(dá)總體變化規(guī)律與前者一致,即都是先升高后降低,但后者峰值提前至2 h,且在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)都低于前者。CGRP8-37作為CGRP的受體拮抗劑,當(dāng)其進(jìn)入血腦屏障后,可與CGRP的受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,從而使得CGRP表達(dá)量大大減少,同時(shí)又具有加快病理狀態(tài)的恢復(fù)作用,即具有減輕CGRP大量釋放所致的水腫和炎癥的作用。這與后續(xù)的動(dòng)物觀察結(jié)果一致,TBI組大鼠在72 h后仍有一半不能正常進(jìn)食和飲水,而給予CGRP8-37的大鼠在48 h后即有三分之二基本恢復(fù)正常,72 h時(shí)除個(gè)別外都能正常活動(dòng)、進(jìn)食和飲水。CGRP8-37作為CGRP的一種特異的受體拮抗劑,可以有效減輕CGRP引起的水腫和炎癥因子的釋放,加快病理狀態(tài)的恢復(fù)。這對(duì)于腦外傷所致的腦水腫甚至腦疝有很好的預(yù)防和治療作用。隨著對(duì)CGRP研究的不斷深入,將會(huì)有更多新的CGRP受體拮抗劑被研發(fā)出來(lái),服務(wù)于臨床。

[1] Feeney DM,Boyeson MG,Linn RT,eta l.Responses to cortical injury methodology and local effects of con tusions in the rat[J].Brain Res,1981,21l(1):67-67.

[2] Ghatta S,Nimmagadda D.Calcitonin gene-related paptide:Understandingits role[J].Indian JPharmmacol,2004,36(5):277-283.

[3] Bucinskaite V,Brodda G,Stenfors C,et al.Increased concentrations of calcitonin gene-related peptide imm unoreactivity in ratb rain and peripheral tissue after ischaem ia:Correlation toflapsu rvival[J].Neu ropetides,1998,32∶179-183.

[4] Nozaki K,Okamoto S,Vemura Y,eta l.Vascular relaxation propertiesof calcitonin gene-related pep tide and vasoactive in testinalpolypeptide in subarachnoid haemorrhage[J].Neurosu rg,1990,72:792-797.

[5] Park SH,H siao GY,Huang GT.Role of substance P and calcitonin gene-related peptide in the regulation of in terleukin-8 and monocy te chem otactic p rotein-1 exp ression in human den talpulp[J].Int Endod J,2004,37(3):185-192.

[6] Yamagu chi M,Kojhm T,Kanekaw a M,etal.Neu ropeptides stim ulatep rodu ction of interleukn-1 beta,interleukin-6 and tum or necrosis factor-alpha in human dental pum p cells[J].Inflamm Res,2004,53(5):199-204.