C57-ras致癌性轉(zhuǎn)基因小鼠模型的臟器及血液學(xué)參數(shù)

左 琴，李 波，岳秉飛，范昌發(fā)

（中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100050）

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液生理生化、臟器重量和臟器系數(shù)等特性參數(shù)，是現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)的一項(xiàng)重要內(nèi)容，是探討疾病發(fā)生機(jī)制、生理學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)等實(shí)驗(yàn)研究的重要參考值。動(dòng)物的血液生理生化、臟器和臟器系數(shù)等參數(shù)不僅受其年齡，性別、生理狀態(tài)、生活環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)水平的影響，也受動(dòng)物的種類、品系、遺傳背景的影響［1］。對(duì)于這些參數(shù)的測(cè)定，已經(jīng)開展了大量的工作［2-5］。這些工作促進(jìn)了動(dòng)物品系，特別是新模型動(dòng)物的推廣和使用。

本文所研究的模型動(dòng)物為C57-ras，是作者單位通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法，將人原癌基因C-Ha-ras（簡(jiǎn)稱ras基因）導(dǎo)入C57小鼠基因組中而自主建立（專利公開號(hào)：CN 101532018A）。該模型將主要用于藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)、抗癌藥物的篩選等領(lǐng)域，以部分替代傳統(tǒng)的耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高的2年期大小鼠致癌性評(píng)價(jià)方法［6］。本實(shí)驗(yàn)背景數(shù)據(jù)的獲得，將為該模型的在致癌性安全評(píng)價(jià)中的使用提供支持，同時(shí)也豐富了國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心的背景數(shù)據(jù)庫(kù)，可更好的為公眾服務(wù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

從人基因組中分離獲得人原癌基因c-Ha-ras，經(jīng)純化處理，顯微注射受精卵細(xì)胞，經(jīng)移植產(chǎn)仔篩選，獲得6只C57-ras首建鼠。將首建鼠與健康普通C57小鼠交配建系傳代動(dòng)物，有3只成功建系［SCXK（京）2005-0004］。本次實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為F5-6代，飼養(yǎng)于本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心的清潔級(jí)環(huán)境，飼喂SPF小鼠顆粒飼料，飲用自來(lái)水。

通過(guò)PCR方法檢測(cè)篩選動(dòng)物。引物設(shè)計(jì)針對(duì)轉(zhuǎn)基因的編碼序列，序列為：上游引物為Pri.PFT：5’-acacgggccgtagctgagtcgagagct-3’，下游引物為Pri.PRN1735：ctgcggtcagcagcctcccttgtgcc。PCR體系按常規(guī)方法建立。

分組：分為ras陰性雌鼠（ras-）、ras陰性雄鼠（ras-）、ras陽(yáng)性雌鼠（ras+）、ras陽(yáng)性雄鼠（ras+）等4組，各組5只動(dòng)物。

1.2 測(cè)試儀器及試劑

日本光電MEK 27222K血球分析儀測(cè)定血液生理指標(biāo)，儀器精度：WBC 210％，RBC 115％，HGB 115％，MCV 110％，PLT 410％。分析試劑是溶血?jiǎng)馜H680，批號(hào)20091207；溶血?jiǎng)駾H910，批號(hào)20091201。

OlympusAU400全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血液生化指標(biāo)，所用生化試劑批號(hào)090381.200911，生產(chǎn)公司是中生北控生物科技股份有限公司。

sartorius BS110S電子天平測(cè)定臟器重量，精度是0.1mg，德國(guó)塞多利斯公司生產(chǎn)。

1.3 采血方法

空腹12h，活體稱重后，眼眶靜脈叢采血，用于血液生理指標(biāo)的測(cè)定。摘眼球采血，用于血液生化指標(biāo)的測(cè)定，最后小鼠頸椎脫臼處死后解剖。

1.4 血液生理指標(biāo)測(cè)定項(xiàng)目及方法［7］

紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血紅蛋白濃度（HGB）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白（MCH）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細(xì)胞分布寬度（RDW）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、平均血小板體積（MPV）、血小板壓積（PCT）和血小板分布寬度（PDW），共22項(xiàng)。

1.5 血液生化指標(biāo)測(cè)定項(xiàng)目及方法［7］

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素（BUN）、肌酐（CREA）、葡萄糖（GLU）、鈣（CA）、磷（P）、總膽固醇（CHO）和甘油三酯（TG）。

1.6 臟器指標(biāo)測(cè)定［8］

分離心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、子宮、睪丸，用生理鹽水清洗血污，吸水紙吸干表面水分，剔除臟器表面脂肪、筋膜后用電子天平稱重，精確到0.0001g。臟器重量以g為單位，臟器系數(shù)以臟器重量/體重×100％表示。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用Excel統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)的均值和方差，進(jìn)行t檢驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

經(jīng)提取DNA，兩次重復(fù)PCR，電泳檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)。兩次重復(fù)，均為陽(yáng)性的判為陽(yáng)性結(jié)果，均為陰性的判為陰性；如果存在結(jié)果不一致的情況，重復(fù)第三次。將轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性（ras+）和陰性的（ras-）小鼠隨機(jī)分組，進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)檢測(cè)和篩選，獲得了20只轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性和陰性動(dòng)物，用于各種參數(shù)測(cè)定。

2.1 血液生理學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

測(cè)定了22項(xiàng)血液生理學(xué)指標(biāo)，詳見表1［7］。ras-雌鼠和ras+雌鼠比較，嗜中性粒細(xì)胞（NEUT）、嗜中性粒細(xì)胞百分比（NEUT％）差異顯著（P＜0.05），血小板壓積（PCT）差異極顯著（P＜0.01）；其余19項(xiàng)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表1 C57-ras轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠的血液生理參數(shù)Tab.1 Blood physiological values of C57-ras transgenic and non-transgenic mice

ras-雄鼠和ras+雄鼠比較，紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、血小板數(shù)（PLT）、血小板壓積（PCT）差異顯著（P＜0.05），單核細(xì)胞百分比（MON％）差異極顯著（P＜0.01）；其余17項(xiàng)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 血液生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

共測(cè)定了12項(xiàng)血液生化指標(biāo)，詳見表2［7］。ras-雌鼠和ras+雌鼠比較，12項(xiàng)生化指標(biāo)均差異不顯著（P＞0.05）。ras-雄鼠和ras+雄鼠比較，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、甘油三酯（TG）差異顯著（P＜0.05），其余10項(xiàng)差異不顯著（P＞0.05）。

表2 C57-ras轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠的血液生化參數(shù)值Tab.2 Serum biochemical values of C57-ras transgenic mice and non-transgenic mice

2.3 臟器重量和臟器系數(shù)比較

ras-雌鼠和ras+雌鼠、ras-雄鼠和ras+雄鼠的體重分別是19.46±0.65g和20.31±4.05g、26.66±2.69g和26.17±1.21g，其主要臟器重量及系數(shù)見表3［4］。ras-雌鼠和ras+雌鼠比較，肺重量差異極顯著（P＜0.01），其余7個(gè)臟器重量及系數(shù)均差異不顯著（P＞0.05）。ras-雄鼠和ras+雄鼠比較，8個(gè)主要臟器的重量和系數(shù)均差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 C57-ras模型在安全評(píng)價(jià)中應(yīng)用

根據(jù)歐洲經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織指導(dǎo)原則（OECD TG 451）規(guī)定，傳統(tǒng)的致癌性評(píng)價(jià)方法是通過(guò)2年期大、小鼠致癌性實(shí)驗(yàn)完成的［6］。這類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用量大、人力和資金成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，受到背景腫瘤的嚴(yán)重干擾，結(jié)果準(zhǔn)確性差［9］。轉(zhuǎn)基因或基因敲除的遺傳修飾動(dòng)物模型的建立，較好的解決了上述問(wèn)題。在國(guó)外，致癌性模型動(dòng)物已經(jīng)實(shí)現(xiàn)模型動(dòng)物商品化供應(yīng)。C57-ras致癌性模型的建立，有望彌補(bǔ)我國(guó)新藥評(píng)價(jià)技術(shù)體系中部分缺憾。

表3 C57-ras轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠的臟器重量及系數(shù)比較Tab.3 Comparison of organ weight and coefficient between C57-ras transgenic mice and non-transgenic mice

3.2 部分血液生理生化參數(shù)存在差異

血液生理生化值反映了動(dòng)物的新陳代謝及生理機(jī)能狀況，是衡量動(dòng)物健康標(biāo)準(zhǔn)及遺傳穩(wěn)定的指標(biāo)，也是臨床疾病診斷的重要依據(jù)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，組間部分血液、生化參數(shù)存在在差異。如ras+和ras-的NEUT、PCT和RBC之間存在差異；生化參數(shù)ALT和TG存在顯著差異。由于所有動(dòng)物均在相同條件下飼養(yǎng)，周齡相同；二者差別體現(xiàn)在是否含有轉(zhuǎn)基因上，即遺傳背景不同?？梢酝茰y(cè)，該差異可能是由于轉(zhuǎn)基因的插入，引起動(dòng)物部分生理生化指標(biāo)改變。

3.3 臟器重量和臟器系數(shù)幾乎無(wú)差異

臟器重量及臟器系數(shù)是衡量動(dòng)物功能狀態(tài)的重要指標(biāo)，也是藥物進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)的指定檢測(cè)項(xiàng)目［11］。從表3可知，ras-雌鼠和ras+雌鼠進(jìn)行比較，肺重量有極顯著性差異（P＜0.01），其余7個(gè)臟器重量及系數(shù)均差異不顯著（P＞0.05）。對(duì)ras-雄鼠和ras+雄鼠進(jìn)行比較，8個(gè)主要臟器的重量和系數(shù)均差異不顯著（P＞0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠和其對(duì)照的正常小鼠在其一致的時(shí)期主要生物學(xué)特性較為一致。

總體而言，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性動(dòng)物和同窩轉(zhuǎn)基因陰性動(dòng)物相比較，其血液生理生化、臟器和臟器系數(shù)相差不大。這對(duì)該模型將來(lái)在臨床前安全評(píng)價(jià)中應(yīng)用將是有利的。

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