新疆北疆某規(guī)?；?chǎng)奶牛副結(jié)核病的檢測(cè)與分析

高建鵬，趙 鑫，高靜雯，李 慧，張 莉，齊亞銀

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832000）

副結(jié)核?。≒aratuberculosis）又稱副結(jié)核腸炎，是由副結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium aviumsubspecies paratuberculosis，MAP）引起的一種慢性傳染病，其臨診特征是慢性卡他性腸炎、頑固性腹瀉和漸進(jìn)性消瘦[1]。該病呈世界性分布，主要感染牛、羊、鹿等反芻動(dòng)物[2]。臨床癥狀主要表現(xiàn)為下痢，排便時(shí)常常表現(xiàn)為噴射狀，且糞便腥臭味嚴(yán)重，后期表現(xiàn)為持續(xù)性下痢，嚴(yán)重者呈現(xiàn)貧血衰竭狀態(tài)，產(chǎn)奶量降低，身體水腫等癥狀。

在檢測(cè)方面，細(xì)菌學(xué)檢查與PCR檢測(cè)是最常用的手段。副結(jié)核分枝桿菌通常采用萋-尼氏抗酸染色法進(jìn)行染色，抗酸桿菌呈特征性的紅色，而其他細(xì)菌和細(xì)胞呈藍(lán)色。1987年，Mcfadden等[3]首次發(fā)現(xiàn)了副結(jié)核分枝桿菌特異性插入片段IS900，使用MAP的IS900片段的PCR檢測(cè)方法也已被作為確診副結(jié)核的檢測(cè)技術(shù)。此外，根據(jù)副結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)特性及致病力又將該菌分為3個(gè)亞型，分別為Ⅰ型（羊型）、Ⅱ型（牛型）與Ⅲ型（生物中間型）。

2017年11月，新疆北疆某規(guī)?；?chǎng)部分奶牛出現(xiàn)消瘦、糞便稀薄惡臭、奶產(chǎn)量下降等癥狀，且癥狀持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。本研究采集了3份可疑糞便處理后進(jìn)行抗酸染色，發(fā)現(xiàn)2份糞便中存在疑似副結(jié)核分枝桿菌的病原菌，后續(xù)分子生物學(xué)檢測(cè)確定了該菌的存在。為了解副結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)特性，本研究對(duì)鏡檢陽(yáng)性的糞便樣品進(jìn)行了分子鑒定，為確診奶牛致病菌及研究該菌的病原學(xué)與分子流行病學(xué)提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 病料新疆北疆某規(guī)模化牛場(chǎng)3份疑似副結(jié)核病牛糞便。

1.2 主要試劑副結(jié)核分枝桿菌參考株（ATCC BAA-968）購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；PMD 19-T購(gòu)自TaKaRa公司；副結(jié)核分支桿菌IS900引物（Primer90/Primer91）[4]及亞型分型引物（DMC529、DMC531、DMC533）[5]均由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

1.3 樣品處理參照中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 1084-2010）[6]處理糞便樣品，具體程序如下：分別取待檢糞樣15 g，加入45 mL的0.5%氫氧化鈉溶液，在容器中進(jìn)行混勻，置于55℃水浴鍋，乳化30 min，紗布網(wǎng)過(guò)濾，濾液在離心機(jī)中以300×g離心5 min，去除沉淀物，再以1700 ×g離心30 min，棄上清。用沉淀進(jìn)行涂片處理，干燥后進(jìn)行抗酸染色，鏡檢觀察分枝桿菌為紅色，其余物質(zhì)為藍(lán)色。將2份陽(yáng)性糞便分別編號(hào)為MAPxj-2038、MAPxj-2126。

1.4 糞便樣品總DNA提取將上述鏡檢陽(yáng)性的糞便按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取細(xì)菌DNA。

1.5 IS900分子鑒定以Primer90/Primer91為引物對(duì)IS900進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5 min；93℃變性1 min、58℃退火1 min、72℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物后連接轉(zhuǎn)化并將菌體送至生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 亞型鑒定以DMC529、DMC531、DMC533為引物對(duì)分離菌的亞型進(jìn)行PCR檢測(cè)，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min。膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物后連接轉(zhuǎn)化并測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 鏡檢結(jié)果將疑似糞樣與副結(jié)核分枝桿菌參考菌株同時(shí)進(jìn)行抗酸染色處理，在糞樣中發(fā)現(xiàn)背景與其他雜菌為藍(lán)色，中間充滿短桿狀，成團(tuán)、成簇的紅色細(xì)菌（圖1A），與抗酸染色的參考菌株（圖1B）對(duì)比，兩者形態(tài)相似，說(shuō)明疑似抗酸染色為陽(yáng)性。

2.2 IS900分子鑒定以提取的基因組為模板，采用副結(jié)核IS900特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，從2份目標(biāo)樣本中均擴(kuò)增得到了一條400 bp條帶，與預(yù)期片段大小相一致（圖2）。將所測(cè)得的IS900基因序列置于GenBank中比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與AE016958.1、A F 4 1 6 9 8 5.1、A J 2 5 0 0 1 8.1、A J 2 5 1 4 3 7.1、CP022095.2、FJ775181.1和X16293.1等同源性在99.0%以上；采用MegLign軟件中Clustal方法進(jìn)行分析，MAPxj-2038與MAPxj-2126的同源性為100%；與其他序列比對(duì)顯示其同源性最低為98.3%，最高為100%（圖3）。

圖1 抗酸染色與鏡檢結(jié)果Fig.1 Acid resistance staining and microscopic examination results

圖2 副結(jié)核分枝桿菌特異性基因PCR 結(jié)果Fig.2 PCR detection results of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis specific gene IS900

2.3 副結(jié)核分枝桿菌亞型鑒定采用副結(jié)核分枝桿菌亞型鑒定引物DMC529、DMC531與DMC533，對(duì)提取糞便基因組DNA進(jìn)行副結(jié)核分支桿菌基因Ⅰ/Ⅲ型和Ⅱ型特異性基因擴(kuò)增。結(jié)果表明，從基因組中成功擴(kuò)增出了約310 bp的目的片段（圖4），與預(yù)期大小一致。

膠回收基因片段后連接、轉(zhuǎn)化并測(cè)序，結(jié)果表明，MAPxj-2038與MAPxj-2126的IS900序列長(zhǎng)度均為312 bp，結(jié)合Collins等[5]公布的Ⅰ型、Ⅱ型序列，本研究擴(kuò)增的基因序列與Ⅱ型基因序列相似性為99.81%，從而確定MAPxj-2038與MAPxj-2126為Ⅱ型副結(jié)核分枝桿菌（圖5）。

圖3 副結(jié)核分枝桿菌IS900 基因序列遺傳分析Fig.3 Sequence genetic analysis of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis IS900 gene

圖4 副結(jié)核分枝桿菌亞型PCR 結(jié)果Fig.4 Subtype PCR results of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis

3 討論

副結(jié)核分枝桿菌為反芻動(dòng)物“約翰病”的致病菌，常用抗酸染色對(duì)糞樣、組織等病料初檢進(jìn)行臨床診斷，但由于宿主排菌的周期性以及其他抗酸陽(yáng)性菌的干擾，鏡檢方法可能會(huì)產(chǎn)生假陰性或假陽(yáng)性的結(jié)果。同時(shí)，由于副結(jié)核分枝桿菌在體外培養(yǎng)非常困難，作為臨床診斷顯然耗時(shí)太長(zhǎng)。另外，該病也可能與人類的“克羅恩病”有關(guān)。Botsaris等[7]在經(jīng)巴氏殺菌的嬰兒配方奶粉中發(fā)現(xiàn)13%（4/32）的奶粉樣品中檢測(cè)到了活的MAP，這說(shuō)明MAP可能會(huì)通過(guò)奶制品等方式產(chǎn)生公共健康問(wèn)題。因此，無(wú)論是在獸醫(yī)臨床的診斷或是公共衛(wèi)生的檢測(cè)方面，能夠快速、準(zhǔn)確的對(duì)MAP進(jìn)行檢測(cè)就顯得尤為重要，而分子生物學(xué)方法既能縮短時(shí)間，也可保證準(zhǔn)確性，是很好的補(bǔ)充手段。

除了IS900基因外，ISMav2、f57和ISMap02等DNA序列在MAP的診斷方面也具有很好的效果[8]；Park等[9]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)血液、乳汁、糞便和組織等樣品中的MAP進(jìn)行檢測(cè)，該技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是快速，但DNA提取方法與提取樣品的質(zhì)量對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性有重要的影響；王建峰等[10]以IS900基因?yàn)榘谢蚪⒌沫h(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)，1 h內(nèi)完成反應(yīng)且具有很好的特異性；Singh等[11]使用磁性納米粒子和色原體檢測(cè)牛奶中活的MAP，并且在10 h之內(nèi)可獲得可靠的結(jié)果。眾多分子生物學(xué)方法被應(yīng)用于臨床檢測(cè)與試驗(yàn)，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

由于糞便傳播是MAP在牛場(chǎng)中主要傳播方式之一，因此從理論上講，環(huán)境中非感染動(dòng)物的糞便檢測(cè)可能導(dǎo)致假陽(yáng)性的發(fā)生[12]。本研究直接從可疑動(dòng)物的直腸中收集糞便，從而避免了上述情況的出現(xiàn)。對(duì)于樣品的處理，尤其是作為后期細(xì)菌培養(yǎng)的處理物，都需要進(jìn)行去污，適當(dāng)?shù)娜ノ鄯椒蓽p少樣品中目標(biāo)生物數(shù)量，提高細(xì)菌的分離成功率。在采集的3份樣本中，1份雖未鏡檢到抗酸染色陽(yáng)性菌，但并不能證明其為陰性結(jié)果，因?yàn)镸AP會(huì)引起宿主體液免疫與細(xì)胞免疫的交替進(jìn)行，造成排菌具有一定的周期性，因此，若要排除假陰性的可能，必須在一段時(shí)間后再次采樣進(jìn)行鏡檢。在亞型分型檢測(cè)中，經(jīng)測(cè)序所得目的序列與Collins等有所不同，分析后發(fā)現(xiàn)，在310 bp的目的片段中，MAPxj-2038與MAPxj-2126在Ⅱ型序列第10位與第302位分別插入了一個(gè)鳥(niǎo)嘌呤，從而導(dǎo)致目的片段增加為312 bp（圖5）。此外，Castellanos[13]、Collins[14]與Ricchi[15]等利用數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）與短序列重復(fù)（SSR）進(jìn)行MAP的亞型分型，結(jié)果表明均有良好的效果。

圖5 副結(jié)核分枝桿菌不同DMC 亞型基因序列比對(duì)結(jié)果Fig.5 Sequence alignment of different DMC subtypes of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis

自副結(jié)核病首次報(bào)道以來(lái)，如何有效防控是該病的研究重點(diǎn)。感染率較低的養(yǎng)殖場(chǎng)可通過(guò)檢疫與淘汰控制該病，而陽(yáng)性率較高的養(yǎng)殖場(chǎng)為避免撲殺造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)新生犢牛進(jìn)行免疫注射，配合必要的衛(wèi)生措施是控制該病的有效方法。近年來(lái)，眾多研究人員正在開(kāi)展副結(jié)核病新型疫苗的研發(fā)工作[16-19]，通過(guò)將具有免疫源性和免疫保護(hù)性蛋白的基因克隆到原核表達(dá)載體中，把表達(dá)的重組蛋白作為疫苗免疫動(dòng)物，從而起到預(yù)防副結(jié)核病的目的。對(duì)于治療，雖然新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及其他一些處于試驗(yàn)階段的氟喹諾酮類抗生素在體外試驗(yàn)有效，但由于價(jià)格昂貴無(wú)法應(yīng)用與生產(chǎn)。總體而言，還未有對(duì)MAP經(jīng)濟(jì)有效的藥物可用。

本研究根據(jù)顯微鏡鏡檢及分子生物學(xué)檢測(cè)確定該牛場(chǎng)患牛被副結(jié)核分枝桿菌（Ⅱ型）感染，為進(jìn)一步開(kāi)展牛型副結(jié)核分枝桿菌的分離培養(yǎng)與該病原的追蹤溯源奠定基礎(chǔ)。