基于電子鼻的氣味指紋技術(shù)在有害微生物檢測中的應(yīng)用

王丹鳳，王錫昌，劉 源，趙 勇，謝 晶，潘迎捷，顧賽麒

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306)

基于電子鼻的氣味指紋技術(shù)在有害微生物檢測中的應(yīng)用

王丹鳳，王錫昌，劉 源*，趙 勇，謝 晶，潘迎捷，顧賽麒

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306)

氣味指紋技術(shù)是借助氣體傳感器等氣體吸附手段，對揮發(fā)性氣味物質(zhì)進(jìn)行分析處理的技術(shù)。隨著嗅覺傳感器技術(shù)的不斷發(fā)展，氣味指紋技術(shù)得到了廣泛的研究與應(yīng)用。本文介紹了基于電子鼻的氣味指紋技術(shù)在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品分析領(lǐng)域有害微生物檢測的實例，展望了其應(yīng)用前景，為以后更好的利用氣味指紋技術(shù)研究有害微生物提供了理論依據(jù)。

氣味指紋技術(shù)，有害微生物，電子鼻，檢測

Abstract:Odor fingerprint technology was used to analyze the volatile compounds by means of gas adsorption such as sensors.With the development of olfactory sensor technology，it was widely studied and applied.In this review，the application examples of odor fingerprint technology in clinical diagnosis，environmental monitoring and food analysis were introduced，the prospect of application was illustrated，expecting to provide the foundation for further research.

Key words:odor fingerprint technology;harmful micro－organisms;electronic nose;detection

指紋分析技術(shù)是近十年來針對復(fù)雜介質(zhì)和含協(xié)同作用的樣品而發(fā)展起來的一項新技術(shù)。其中基于電子鼻的氣味指紋技術(shù)具有成本低、操作程序簡單、客觀、可靠等方面的優(yōu)點，如今已經(jīng)得到深入的研究與廣泛的應(yīng)用。電子鼻是一種由一定選擇性的電化學(xué)傳感器陣列和適當(dāng)?shù)淖R別裝置組成的儀器，能識別簡單和復(fù)雜的氣味［1］。其工作原理如下:a.氣味分子被電子鼻中的傳感器陣列吸附，產(chǎn)生信號;b.生成的信號經(jīng)加工處理與傳輸;c.將處理后的信號經(jīng)模式識別系統(tǒng)做出判斷。不同的微生物由于產(chǎn)生的酶類不同，從而對基質(zhì)的分解產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不同。另外，由于微生物生長要經(jīng)歷延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期四個階段，所以同一微生物在不同生長階段產(chǎn)生的揮發(fā)性氣味產(chǎn)物(MVOCs)濃度也有差異［2］。目前檢測MVOCs的方法主要有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)［3－4］、質(zhì)譜法(MS)和電子鼻(EN)法等。雖然MVOCs含量通常較低，但電子鼻靈敏度極高(檢出限為ppm級)，故在此方面應(yīng)用前景廣闊。本文主要分析基于電子鼻的氣味指紋技術(shù)對有害微生物的檢測，總結(jié)了其在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品分析中的應(yīng)用，為更好應(yīng)用該技術(shù)對微生物的檢測提供參考。

1 臨床診斷

一直以來感染性疾病都是危害人類健康的重大隱患，尤其是在第三世界國家。目前造成感染性疾病的微生物種類日益繁多，出現(xiàn)次數(shù)越來越頻繁，這些嚴(yán)峻的現(xiàn)實給病原微生物的檢測和診斷提出了更高的要求。因此，研究和發(fā)展一種病原微生物的快速檢測技術(shù)，準(zhǔn)確、快捷地確認(rèn)與檢測病原體，對感染性疾病的臨床治療和預(yù)后有重要意義。

早在上世紀(jì)90年代國外就開始利用氣味指紋技術(shù)來診斷感染性疾病，1995年P(guān)arry AD等利用20根導(dǎo)電聚合物電子鼻對腿部潰瘍產(chǎn)生的特殊氣味物質(zhì)進(jìn)行分析，指出二維氣味譜圖可以明確區(qū)分金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和鏈球菌(Streptococcus species)感 染 引 起 的 潰 瘍［5］。A.K.Pavlou等利用電子鼻對體外幽門螺旋桿菌和其它胃食管菌株進(jìn)行了研究。對電子鼻數(shù)據(jù)利用判別函數(shù)分析可以成功區(qū)分6種不同細(xì)菌［6］。

進(jìn)入21世紀(jì)以來，更多研究者對利用氣味指紋技術(shù)來診斷疾病產(chǎn)生了濃厚的興趣，相關(guān)的研究成果也不斷展示在世人面前。2002年Alexandros K等利用細(xì)菌感染尿樣后產(chǎn)生氣味物質(zhì)的不同，在兩輪實驗中分別對25個和45個來自尿路感染病人的尿樣進(jìn)行研究。所有實驗樣本振蕩培養(yǎng)4～5h，利用14根導(dǎo)電聚合物傳感器分析。第一輪實驗利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將所有樣本分為4組:正常尿樣、大腸桿菌(Escherichia coli)污染的尿樣、變形桿菌(Proteus spp.)污染尿樣、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)污染尿樣。第二輪實驗同樣利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確定了18～19個未知尿樣的感染菌種，僅一個正常尿樣被誤認(rèn)為成大腸桿菌污染尿樣。利用判別函數(shù)分析還區(qū)分了大腸桿菌和葡萄球菌感染的尿樣。該研究第一次指出，可以利用細(xì)菌感染尿樣揮發(fā)出的氣味物質(zhì)對早期感染的尿樣進(jìn)行檢測，并有可能在臨床上利用［7］。2006年英國的 Ritaban Dutta等采用Cyranose320陣列組成的32根聚合物碳黑復(fù)合傳感器對六種感染眼部的細(xì)菌進(jìn)行了分類，對比了多層感知、概率神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和徑向基函數(shù)網(wǎng)絡(luò)(RBF網(wǎng)絡(luò))三種分類方法，結(jié)果表明應(yīng)用RBF網(wǎng)絡(luò)對此六種細(xì)菌的檢測率可達(dá)到 98%［8］。2006年A.Setkus等分析了金屬氧化物傳感器陣列對細(xì)菌揮發(fā)性產(chǎn)物的動態(tài)響應(yīng)、動力學(xué)參數(shù)和培養(yǎng)基特性的相關(guān)性。指出可以通過動態(tài)響應(yīng)參數(shù)評估細(xì)菌污染程度［9］。2008年A.Setkus等又對引起傷口感染的細(xì)菌的特殊揮發(fā)性氣體進(jìn)行研究，結(jié)果表明:時間常數(shù)和權(quán)重系數(shù)同活菌產(chǎn)生的揮發(fā)氣體特性和活菌類型密切相關(guān)。指出使用氣體傳感器系統(tǒng)利用細(xì)菌作用產(chǎn)生的特殊氣味，可以確定傷口感染類型和感染階段［10］。2008年 Natasha Sahgal等利用混合氣體傳感器陣列對引起人和動物皮膚癬的真菌進(jìn)行了區(qū)分和菌種鑒定，同時還證明了應(yīng)用氣味指紋技術(shù)可以有效地縮短對人類和動物感染皮膚癬菌的鑒定時間［11］。

國內(nèi)胥勛濤等2009年利用可對氣體濃縮的電子鼻對病原菌的特性揮發(fā)氣味進(jìn)行濃縮，從而對傷口病原菌快速檢測。針對病原菌檢測中特征氣體濃度低，電子鼻識別效果不好的問題，設(shè)計并實現(xiàn)了一個基于固體吸附/熱解吸技術(shù)的氣體濃縮系統(tǒng)，系統(tǒng)由流速控制單元、溫度控制單元和填裝混合吸附劑的吸附管構(gòu)成。對測試數(shù)據(jù)主成分分析和層次聚類分析結(jié)果表明，結(jié)合此電子鼻系統(tǒng)，利用傷口病原菌的特性氣味物質(zhì)使對傷口病原菌的區(qū)分能力得到明顯提高，可進(jìn)一步用于傷口感染實時檢測［2］。

氣味指紋技術(shù)作為一種新技術(shù)已經(jīng)用于感染細(xì)菌的研究，與常規(guī)醫(yī)學(xué)檢驗方法相比，具有無創(chuàng)、實時、便捷高效等優(yōu)點，因此在引起疾病的微生物的檢測方面具有潛在的優(yōu)勢。同時由于它是一種新技術(shù)，其應(yīng)用還存在一定的限制，究其原因主要是因為以下兩點:a.感染細(xì)菌產(chǎn)生的揮發(fā)性氣味物質(zhì)濃度低:b.現(xiàn)階段的氣體傳感器靈敏度還沒有達(dá)到預(yù)期的高度，不能對低濃度的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測。在更多研究學(xué)者、研究機(jī)構(gòu)的共同努力下，相信其在臨床上的廣泛應(yīng)用終將實現(xiàn)。

2 環(huán)境監(jiān)測

近年來，由于環(huán)境污染導(dǎo)致的健康損害和其它問題不斷增加，這其中不乏微生物的污染，尤其是真菌污染尤為嚴(yán)重。2005年Martyna Kuske等利用微生物的揮發(fā)性有機(jī)化合物作為真菌指示物，快速的檢測出了建筑物的真菌污染，區(qū)分了物品霉變與否，鑒別出了真菌的種類［12］。水中鏈霉菌(Streptomyces)會產(chǎn)生特殊的土腥氣味，A.Catarina Bastos等利用電子鼻對水中的鏈霉菌進(jìn)行檢測，主成分分析和判別函數(shù)分析的結(jié)果表明:可以利用氣味指紋技術(shù)用來檢測和監(jiān)測水中早期的霉菌污染，并且可以根據(jù)其揮發(fā)性生產(chǎn)模式不同，區(qū)分細(xì)菌種類［13］。

葡萄球菌(S.aureus)感染在住院病人中日益廣泛，尤其重癥監(jiān)護(hù)患者中受耐甲氧西林的凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)感染更為突出。該類細(xì)菌在人體和自然環(huán)境中天然存在，醫(yī)院環(huán)境中存在該菌更加劇了病人的感染風(fēng)險，因此需對此類細(xì)菌污染醫(yī)院環(huán)境的早期進(jìn)行檢測并進(jìn)行相應(yīng)處理。英國Warwick大學(xué)的Ritaban Dutta等人從醫(yī)院耳、鼻、喉三個疫區(qū)感染此類細(xì)菌的患者中收集樣本，利用炭黑導(dǎo)電聚合物復(fù)合傳感器電子鼻(C－320)分析樣本的揮發(fā)性氣味物質(zhì)，識別和檢測了醫(yī)院環(huán)境中三種不同的金黃色葡萄球菌，結(jié)合多層感知、概率神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和徑向基函數(shù)網(wǎng)絡(luò)(radial basis function network，RBF網(wǎng)絡(luò))進(jìn)行分類，結(jié)果顯示應(yīng)用C－320傳感器結(jié)合RBF網(wǎng)絡(luò)對三個亞類金黃色葡萄球菌的分類準(zhǔn)確度高達(dá)99.69%［14］。2006年 Ritaban Dutta等再次對醫(yī)院耳、鼻、喉三個疫區(qū)金黃色葡萄球菌的污染進(jìn)行研究，對出現(xiàn)在醫(yī)院這些疫區(qū)標(biāo)準(zhǔn)瓊脂溶液中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin－resistant S.aureus，MRSA)和易染金黃色葡萄球菌(methicillinsusceptible S.aureus，MSSA)進(jìn)行了鑒定。研究基于貝葉斯定理和最大概率規(guī)則建立了一種創(chuàng)新的分類方法，分析了三個疫區(qū)的金黃色葡萄球菌。同時利用兩種不同的統(tǒng)計量特征提取技術(shù)，最佳結(jié)果顯示:利用自適應(yīng)核方法，可以識別和分類三種細(xì)菌，準(zhǔn)確度高達(dá)99.83%。研究證明最大概率規(guī)則為基礎(chǔ)的分類方法，對于鑒定金黃色葡萄球菌感染醫(yī)院環(huán)境和對其進(jìn)行快速檢測，可以提供一個強(qiáng)大的解決方案［15］。Ritaban Dutta等的兩次研究充分說明了利用氣味指紋技術(shù)在早期即可發(fā)現(xiàn)醫(yī)院環(huán)境是否受到金黃色葡萄球菌的污染，為下一步的處理工作提供了快速而又可靠的依據(jù)。

利用氣味指紋技術(shù)對環(huán)境微生物的檢測和監(jiān)測使用還不夠廣泛，但卻提供了新的思路。并且氣味指紋技術(shù)具有實時、高效、費(fèi)用低等優(yōu)點，如果應(yīng)用得當(dāng)，將會極大的提高對環(huán)境微生物檢測及監(jiān)測的效率，增強(qiáng)對環(huán)境的監(jiān)測力度，同時也能較好的保證人類的生存健康。

3 食品分析

3.1 谷物微生物的檢測

據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織估計，全世界每年大約有5%～7%的糧食、飼料等農(nóng)作物受霉菌侵染。氣味指紋技術(shù)似乎更適宜對谷物質(zhì)量的檢測，尤其是對谷物霉菌污染的檢測。Jonsson等利用不同的傳感器陣列，分析了燕麥、黑麥、大麥、小麥的揮發(fā)性氣味物質(zhì)，基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的模式識別技術(shù)，根據(jù)霉菌作用程度不同產(chǎn)生的特征性氣味不同，高度準(zhǔn)確的區(qū)分了燕麥的等級:好的、輕微霉變、強(qiáng)烈發(fā)霉［16］。Keshri G等從谷物糧食中分離六種腐敗真菌，在實驗室中培養(yǎng)，用電子鼻對不同菌株揮發(fā)性氣味進(jìn)行分析，利用主成分分析、判別函數(shù)分析、聚類分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，可以區(qū)分其中的五種真菌［17］。利用同樣的電子鼻系統(tǒng)，Keshri G等區(qū)分了串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)和樓鐮刀菌(F.proliferatum)的產(chǎn)毒素與否，從而可以做出糧食是否食用安全的結(jié)論［18］。Falasconi等利用真菌的頂空揮發(fā)性化合物作為其毒素的標(biāo)記物，用電子鼻嗅覺系統(tǒng)檢測了玉米中產(chǎn)毒素的鐮刀菌株［19］。Juliusz Perkowski等利用氣味指紋技術(shù)對自然污染和接種鐮刀菌的小麥和黑麥的真菌揮發(fā)物質(zhì)進(jìn)行分析，GC/MS和電子鼻分析了4組谷仁，同時對36個小黑麥育種線和22個小麥育種線進(jìn)行分析，糧食樣本接種鐮刀菌，而不接種的作為對照，根據(jù)所有樣品中鐮刀菌的前體代謝物TRICH(trichodiene)的濃度高低預(yù)測其真菌污染程度。通過田間與實驗室實驗比較，實驗室接種真菌動蕩培養(yǎng)的揮發(fā)性氣味比田間自然感染的高［20］。

近年來，國內(nèi)也將電子鼻無損檢測技術(shù)應(yīng)用到了谷物的檢測中，并進(jìn)行了探索與利用。如鄒小波和趙杰文研制出一套能快速檢測谷物霉變與否的電子鼻裝置，能快速、準(zhǔn)確地分析所測谷物散發(fā)的氣味，從而判定谷物是否霉變［21］。潘天紅等研制出一套谷物霉變識別電子鼻系統(tǒng)測試裝置，能快速準(zhǔn)確地判別幾種谷物的霉變情況，網(wǎng)絡(luò)的識別正確率為92.19%［22］。張紅梅等研制出一套適合對谷物霉變進(jìn)行檢測的電子鼻系統(tǒng)，采用BP(Back Propagation)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對6個霉變程度的稻谷進(jìn)行了檢測，對30組測試樣本霉變菌落總數(shù)的預(yù)測結(jié)果平均相對誤差為1.01030，最大相對誤差為3.94257，可以看出利用氣味指紋技術(shù)對谷物微生物數(shù)量的預(yù)測是可行的［23］。

3.2 肉品微生物研究

肉品營養(yǎng)豐富，是微生物繁殖的天然培養(yǎng)基，容易受微生物污染而引起腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生特定的氣味物質(zhì)，基于這點，已有學(xué)者利用氣味指紋技術(shù)來研究肉品的品質(zhì)。Horvath等利用電子鼻系統(tǒng)評估了豬肉排骨的細(xì)菌腐敗，分析了存儲在4、8和12℃下豬排骨的頂空揮發(fā)物，用電子鼻的化學(xué)傳感器信號監(jiān)測了獨(dú)立成分分析(Independent component analysis，ICA)處理電子鼻數(shù)據(jù)，預(yù)測了受污染牛肉的鼠傷寒沙門氏菌數(shù)量。電子鼻檢測接種鼠傷寒沙門氏菌20℃條件下存儲牛肉的頂空揮發(fā)性氣味變化。提取電子鼻的6根傳感器的特征值，然后通過主成分分析和獨(dú)立成分分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行提取，同沙門氏菌數(shù)量做比較，分別建立了基于IC和PC的線性回歸預(yù)測模型?；贗C的預(yù)測模型的平均預(yù)測精度為82.99%，根均誤差為0.803。基于PC的預(yù)測模型的平均預(yù)測精度為69.64%，根均誤差為1.358。最小線性回歸分析用來確定微生物含量與電子鼻響應(yīng)信號、細(xì)菌腐敗程度之間的關(guān)系，與儲藏溫度無關(guān)。研究給出了預(yù)測數(shù)據(jù)和真實數(shù)據(jù)之間的相互關(guān)系［24］。S.Balasubramanian利用ICA提取的特征數(shù)據(jù)構(gòu)建的預(yù)測模型預(yù)測性能較PCA的更好，相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.91。結(jié)果顯示利用諸如ICA的高階統(tǒng)計技術(shù)比主成分分析能獲得更多的信息進(jìn)而可以改善傳感器性能，以后的進(jìn)一步研究可以利用ICA提取特征數(shù)據(jù)，利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來建立預(yù)測模型［25］。

4 展望

氣味指紋技術(shù)是一種操作簡單、快速、準(zhǔn)確的無損分析技術(shù)，發(fā)展至今仍處于初級發(fā)展階段。應(yīng)用氣味指紋技術(shù)對有害微生物的分析，現(xiàn)已應(yīng)用到了疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品分析等領(lǐng)域，包括對有害微生物的鑒定、區(qū)分、定量預(yù)測等。但是由于一些因素的影響，例如:臨床診斷中，有害微生物氣味濃度低;環(huán)境微生物監(jiān)測時，環(huán)境中其他物質(zhì)的揮發(fā)物的影響;食品分析中，影響因素較為復(fù)雜，微生物在食品這一豐富的“培養(yǎng)基”中生長，不僅其本身代謝會產(chǎn)生氣味物質(zhì)，食品在微生物作用下也會產(chǎn)生復(fù)雜的變化，同樣會有揮發(fā)性氣味物質(zhì)產(chǎn)生等，給研究帶來許多的不便，有待以后進(jìn)一步研究。

氣味指紋技術(shù)在發(fā)展過程中，還受到傳感器靈敏度、模式識別等技術(shù)方面的影響。這些因素直接或間接的影響了氣味指紋技術(shù)的廣泛應(yīng)用，相信隨著不斷深入的研究與創(chuàng)新，氣味指紋技術(shù)的應(yīng)用前景將更加廣闊。

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Application of odor fingerprint technology based on electronic nose for the research in harmful micro－organisms detection

WANG Dan－feng，WANG Xi－chang，LIU Yuan*，ZHAO Yong，XIE Jing，PAN Ying－jie ，GU Sai－qi
(College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，shanghai 201306，China)

TS207.4

A

1002－0306(2010)08－0373－04

2009－08－03 *通訊聯(lián)系人

王丹鳳(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:食品營養(yǎng)與安全。

“十一五”國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)課題(2008AA100804);上海市科委重大科技攻關(guān)項目(07DZ19508);上海市科委啟明星計劃(07QA14047);國家自然基金項目(30901125)。