組織因子途徑抑制物-1與深靜脈血栓形成的研究進(jìn)展

寧 亞 李 文

(昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科,云南 昆明 650032)

深靜脈血栓 (DVT)指深靜脈管腔內(nèi)血液的異常凝結(jié),常見(jiàn)于創(chuàng)傷或手術(shù)后患者,好發(fā)于下肢,若不及時(shí)發(fā)現(xiàn)并對(duì)其進(jìn)行有效治療,早期可因血栓栓塞局部深靜脈管腔導(dǎo)致疼痛性股青腫,或血栓脫落繼發(fā)致命性肺栓塞;晚期遺留深靜脈瓣功能不全,成為嚴(yán)重危害患者健康的疾病之一。血液中存在一套相互拮抗的凝血和抗凝血系統(tǒng),在正常情況下,通過(guò)復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)節(jié)保持動(dòng)態(tài)平衡,既維持血液在血管內(nèi)呈液體流動(dòng)狀態(tài),又在一旦出現(xiàn)血管破裂的情況下迅速在局部凝固形成止血栓,防止出血。若凝血和抗凝血過(guò)程中出現(xiàn)調(diào)節(jié)障礙或凝血系統(tǒng)在心血管內(nèi)被不適當(dāng)激活,從而造成血栓形成。因此,研究血栓形成的分子機(jī)制,明確其核心調(diào)控因素,找到特異、靈敏、快速早期預(yù)測(cè)診斷 DVT形成的分子標(biāo)記物并明確有效的藥物靶點(diǎn)將對(duì) DVT高?；颊哌M(jìn)行更有針對(duì)性、個(gè)性化防治具有重大現(xiàn)實(shí)意義。組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)為庫(kù)尼(Kunitz)型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族蛋白,分為 TFPI-1和-2。但二者在基因序列、組織來(lái)源、分布及其生理作用等方面存在較大差異。TFPI-1作為外源性凝血途徑的特異性抑制物,在抑制血栓形成和血管重塑等方面發(fā)揮重要作用;還與炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化(AS)、腫瘤、敗血癥等疾病相關(guān)〔1〕,其重要的生理學(xué)意義和對(duì)血栓性疾病的治療價(jià)值引人關(guān)注。本文主要綜述 TFPI-1在DVT相關(guān)方面的研究進(jìn)展。

1 TFPI-1來(lái)源與分布

TFPI-1主要由微血管內(nèi)皮細(xì)胞合成,血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、腎小球細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及血小板、T淋巴細(xì)胞等其他細(xì)胞也有少量表達(dá)〔2〕。TFPI-1在體內(nèi)的分布大致分為 3部分:①結(jié)合于內(nèi)皮細(xì)胞腔面,占總量的 50%～80%;②血液中占 10%～50%,大部分與脂蛋白結(jié)合,小部分以游離形式存在;③血小板中約占 8%。Dahm等發(fā)現(xiàn)總 TFPI-1和游離型 TFPI-1減少是 DVT的危險(xiǎn)因素〔3〕。正常人血漿 TFPI-1含量為 54～142 ng/ml,在體內(nèi)由肝和腎負(fù)責(zé)清除,凝血酶和肝素可改變體內(nèi) TFPI-1分布。

2 TFPI-1結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

2.1 基因結(jié)構(gòu) TFPI-1的編碼基因定位于 2q31-2q32,基因全長(zhǎng) 70kb,包括 9個(gè)外顯子和 8個(gè)內(nèi)含子。外顯子 1和 2編碼TFPI mRNA的 5′端非翻譯區(qū),外顯子 3編碼信號(hào)肽及N末端,外顯子 4、6、8分別編碼 TFPI的 K 1、K 2和 K 3結(jié)構(gòu)域,外顯子 5和 7編碼 K 1、K 2和 K 3之間的兩段連接區(qū),外顯子 9編碼 C末端和 3′端非翻譯區(qū)。TFPI-1 mRNA啟動(dòng)子沒(méi)有典型的 TATA盒和 CAAT盒,而是在 5′側(cè)區(qū)的 508和 521胞嘧啶上有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)〔4,5〕。

2.2 蛋白結(jié)構(gòu) TFPI-1是 276個(gè)氨基酸殘基組成的耐熱單鏈糖蛋白,由 3個(gè)重復(fù)的 Kunitz結(jié)構(gòu)域(K1、K 2和 K 3)、一個(gè)富含酸性氨基酸的 N端和一個(gè)富含堿性氨基酸的C端構(gòu)成。TFPI-1所含 18個(gè)半胱氨酸殘基構(gòu)成 9對(duì)二硫鍵,參與維持其二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域 K1和 K 2是 TFPI發(fā)揮抗凝活性的關(guān)鍵部位,分別與 TF/VⅡa復(fù)合物和FⅩa發(fā)生靜電相互作用,最后形成TFFVⅡa-TFPI-Ⅹa四聚體,中斷外源性凝血途徑級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔6〕。結(jié)構(gòu)域 K3和 C端可以和肝素、膜表面糖蛋白及多糖結(jié)合〔7〕,無(wú)直接抑制蛋白酶的功能,但它和C端對(duì)于肝素和細(xì)胞表面的結(jié)合是必需的,對(duì)TFPI-1的整體抗凝活性具有重要意義,并對(duì) K 2結(jié)構(gòu)域結(jié)合到 FⅩa上可能起定位作用〔8〕。

3 TFPI-1生理功能

3.1 TFPI-1與外源性凝血途徑 1964年,MacFarlane和Davie等分別同時(shí)提出了凝血瀑布學(xué)說(shuō)。隨后,逐漸形成了凝血理論的傳統(tǒng)瀑布學(xué)說(shuō),認(rèn)為凝血過(guò)程由外源途徑(extrinsic pathway)、內(nèi)源途徑(intrinsic pathway)和共同途徑(common pathway)組成,其中外源性凝血途徑是生理性止血的主要途徑。血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí),內(nèi)皮下細(xì)胞表面組織因子(TF)暴露于血液,外源性凝血途徑立即啟動(dòng)。TF與血液中少量的 FⅦ(FⅦa)結(jié)合,形成 FⅦa/TF復(fù)合物,而后活化 FⅩ和少量 FⅨ,活化的 FⅩ(FⅩa)激活凝血酶原變?yōu)槟?從而引起凝血,少量 FⅨa對(duì) FⅩ的激活則產(chǎn)生放大作用。Lu〔9〕等人通過(guò)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),生理?xiàng)l件下 FⅦa/TF活化的產(chǎn)物中,FⅨa的活性明顯超過(guò) FⅩa的活性,提出外源性凝血途徑的早期是以 FⅨ 活化為主,而 FⅩa則更傾向于是 FⅨa的活化產(chǎn)物。

外源性凝血途徑主要受 TFPI-1抑制調(diào)節(jié),其對(duì)FVⅡa/TF復(fù)合物的抑制作用是通過(guò)兩步完成:①TFPI-1通過(guò)K2與活化的 FⅩa結(jié)合,形成 FⅩa/TFPI-1復(fù)合物,競(jìng)爭(zhēng)性地抑制 FⅩ的活性,該過(guò)程是一個(gè) Ca2+非依賴(lài)的可逆性過(guò)程,但必須有因子Ⅹa的活性基團(tuán)及 TFPI-1的 K2抑制區(qū)的作用;②FⅩa/TFPI-1復(fù)合物中的 TFPI-1通過(guò)K 1與 FⅦa/TF復(fù)合物中的 FⅦa活性部位結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)對(duì) FⅦa/TF復(fù)合物的抑制。FⅩa輕鏈中谷氨酸殘基上的 γ-羧基與 Ca2+結(jié)合,并通過(guò)“鈣橋”結(jié)合于 FⅩa/FⅦa/TF復(fù)合物中 TF附近的磷脂表面,使得 FⅩa/TFPI-1與Ⅶa/TF形成穩(wěn)固的FⅩa/TFPI-1/Ⅶa/TF復(fù)合物,該復(fù)合物可以被單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等吞噬清除。TFPI-1對(duì) VⅡa/TF的抑制反應(yīng)是一種化學(xué)定量反應(yīng),并且每一步都是可逆的。TFPI的 K1與K 2抑制區(qū)是其發(fā)揮作用的主要位點(diǎn),在抑制過(guò)程中具有重要意義。FⅩa/TFPI-1復(fù)合物在外源性凝血途徑活化的起始階段對(duì) FⅦa/TF進(jìn)行抑制,從而在根本上阻斷 FⅩ和FⅨ的大量活化,避免了凝血因子及抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)等抑制因子的大量消耗。由此可見(jiàn),TFPI-1在外源性凝血途徑的負(fù)反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

3.2 TFPI-1與肝素的抗凝作用 肝素是臨床上應(yīng)用最多的抗凝藥物,其通過(guò)與 AT-Ⅲ結(jié)合,增強(qiáng)后者的抗凝活性而發(fā)揮間接抗凝作用〔10〕,同時(shí)還抑制凝血因子 FⅨ a、FⅩ a、FⅪa和 FⅫa的活性。Hansen等〔11〕研究結(jié)果表明,肝素可以促進(jìn)培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞 TFPI-1的分泌。

王建文等〔12〕研究結(jié)果表明,無(wú)肝素連續(xù)血液凈化治療過(guò)程中,TFPI-1呈上升趨勢(shì),而使用肝素抗凝其上升幅度更為顯著,且呈劑量依賴(lài)性增加,說(shuō)明肝素可通過(guò)增加血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌TFPI-1而增強(qiáng)其抗凝作用。此外免疫阻斷TFPI-1,肝素的抗凝效果明顯下降,表明肝素的抗凝作用有賴(lài)于 TFPI-1。體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),肝素和TFPI-1還具有協(xié)同作用。故可以認(rèn)為肝素的抗凝作用與 TFPI-1有密切的關(guān)系。

Vignoli等〔13〕研究顯示,肝素可抑制炎癥介質(zhì)(脂多糖)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞組織因子 mRNA表達(dá)量及活性。Mousa等〔14〕發(fā)現(xiàn)不同分子量的肝素對(duì)血漿TFPI-1的影響不同,低分子量肝素可使內(nèi)皮細(xì)胞 TFPI-1的合成和分泌增加。

4 TFPI-1研究進(jìn)展

4.1 TFPI-1基因多態(tài)性與 DVT DVT受多因素、多系統(tǒng)調(diào)控,調(diào)控機(jī)制復(fù)雜。是凝血-抗凝、纖溶-抗纖動(dòng)態(tài)平衡破壞的最終結(jié)果。一方面由于體內(nèi)異常凝血的復(fù)雜性,另一方面是由于缺少合適的動(dòng)物模型和前沿研究手段,致使 DVT的機(jī)制研究滯后。其病因和發(fā)病機(jī)制尚未清楚,但大量流行病學(xué)研究結(jié)果表明,遺傳基因在DVT發(fā)病過(guò)程中可能起著重要的作用。TFPI-1基因存在著基因變異及基因多態(tài)性,目前許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者試圖從分子遺傳學(xué)角度探討 TFPI-1基因多態(tài)性是否與DVT相關(guān),從而進(jìn)一步揭示DVT的發(fā)病機(jī)制。

Miyata等〔15〕首次報(bào)道 TFPI-1 C-399T(CTT-TTT)轉(zhuǎn)換,并認(rèn)定該突變并不改變TFPI-1蛋白的表達(dá),亦與靜脈血栓形成無(wú)關(guān)。Kleesiek等〔16〕發(fā)現(xiàn)靜脈血栓形成患者 P151L多態(tài)性的頻率高于志愿者,認(rèn)為P151L與易栓癥顯著相關(guān),并與靜脈血栓形成危險(xiǎn)性有關(guān)。Amezianne等〔17〕認(rèn)為內(nèi)含子 7CC基因型是靜脈血栓形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,可能是介導(dǎo)TFPI-1水平升高的作用。Sidelmann等〔18〕臨床試驗(yàn)結(jié)果表明,急性 DVT形成患者較無(wú)血栓患者 TFPI-1的濃度顯著升高,而此與-33T/C多態(tài)性、內(nèi)皮細(xì)胞炎癥等無(wú)關(guān),可能與纖維蛋白沉淀中TFPI-1的釋放有關(guān)。姜?jiǎng)姷取?9〕采用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析及DNA測(cè)序,對(duì)比了 62例 DVT患者和 50例正常漢族人的 TFPI-1基因序列,認(rèn)為 TFPI-1基因可能不是中國(guó)漢族人 DVT的主要易感基因,但 5號(hào)內(nèi)含子中單核苷酸“G”插入有深入研究?jī)r(jià)值。劉秀娥等〔20,21〕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TFPI-1基因 C-399T多態(tài)性與靜脈血栓形成易感性有關(guān),純合突變基因型可能是靜脈血栓栓塞的重要危險(xiǎn)因素;T-287c與TF啟動(dòng)子-1208I/D基因多態(tài)性與我國(guó)人群靜脈血栓栓塞發(fā)病沒(méi)有顯著相關(guān)性,該基因可能不是中國(guó)漢族人的易感基因。

目前 TFPI-1基因多態(tài)性與DVT形成的關(guān)系研究仍處于初始階段,對(duì)其是否是DVT的遺傳性危險(xiǎn)因素尚無(wú)定論,可能存在基因多態(tài)性之間的相互作用或連鎖不平衡等機(jī)制,尚有待于進(jìn)一步多地域、多種族、大樣本量廣泛深入研究,從而可能為DVT的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)、防治提供一條新的線索和途徑。

4.2 重組 TFPI-1對(duì) DVT的防治 TFPI-1與 DVT關(guān)系密切,天然 TFPI-1在正常人體內(nèi)含量極少、提取率很低較難獲得,目前國(guó)內(nèi)外已有多種生產(chǎn)重組 TFPI-1(rTFPI-1)的方法,也已有相應(yīng)產(chǎn)品面市,并陸續(xù)開(kāi)展臨床試驗(yàn)。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明,rTFPI-1能明顯提高或延長(zhǎng)大鼠、小鼠、豬等感染性休克和彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)模型動(dòng)物的存活率,減輕炎癥反應(yīng)、抑制凝血反應(yīng)和防止血栓形成,減輕肺、脾、肝、腎等臟器損傷〔22,23〕。 Yin等〔24〕報(bào)道,在血管壁進(jìn)行 TFPI-1基因轉(zhuǎn)移可防止局部血栓形成和狹窄而無(wú)出血危險(xiǎn)。Chen等〔25〕通過(guò)對(duì)小鼠模型的研究,推測(cè)靶向應(yīng)用rTFPI于內(nèi)皮細(xì)胞,可改善全身抗凝治療,同時(shí)盡量減少潛在出血的副作用。Holst等〔26〕證明使用重組人 TFPI-1-161(即缺乏 K 3和 C末端的 TFPI)治療兔頸靜脈血栓時(shí),有著與肝素同樣的效力,但出血等不良反應(yīng)明顯減少。因此,rTFPI-1有可能取代肝素應(yīng)用于術(shù)后 DVT的預(yù)防和治療。Klement等〔27〕認(rèn)為雖然 rTFPI-1等抗凝藥物部分在臨床試驗(yàn)中顯示了良好的效果,但大部分仍處于動(dòng)物動(dòng)/靜脈血栓模型階段,抗凝血過(guò)程同時(shí)會(huì)影響到傷口愈合、炎癥、血管生成、細(xì)胞分裂、凋亡等過(guò)程,所以需進(jìn)一步發(fā)展和嚴(yán)格的審核。

5 展 望

隨著分子生物學(xué)與基因工程的發(fā)展與應(yīng)用,人們將會(huì)進(jìn)一步了解 TFPI-1的抗凝作用機(jī)制,明確其基因多態(tài)性與 DVT的聯(lián)系,TFPI-1有望作為一種簡(jiǎn)便、安全、快速、特異性和準(zhǔn)確性高的 DVT預(yù)測(cè)診斷分子標(biāo)記。而安全、高效的rTFPI-1藥物也將研制成功并應(yīng)用于臨床,在測(cè) DVT的防治、降低 DVT危害性、減輕傳統(tǒng)抗凝治療出血副作用等方面發(fā)揮積極作用,具有極大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

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