雞生化基因位點檢測方法的建立及在SPF雞群中的應用

韓凌霞，高鵬飛，2，劉霄磊，司昌德，曲連東

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心，哈爾濱 15001; 2.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷 030801)

研究報告

雞生化基因位點檢測方法的建立及在SPF雞群中的應用

韓凌霞1，高鵬飛1，2，劉霄磊1，司昌德1，曲連東1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心，哈爾濱 15001; 2.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷 030801)

目的建立雞生化標記檢測方法，用于SPF雞群的遺傳學檢測。方法參照國家標準《實驗動物近交系小鼠、大鼠生化標記檢測方法》，應用乙酸纖維素板，建立SPF雞生化標記位點的檢測方法。結果共有7種同工酶可以用于雞的生化檢測，其中血紅蛋白－β鏈(Hbb)的檢測組織為溶血素，轉(zhuǎn)鐵蛋白酶(Trf)的檢測組織為肺臟，碳酸酐酶－2(Car2)的檢測組織為肝臟或溶血素，異檸檬酸脫氫酶－1(Idh1)、蘋果酸酶－1(Mod1)、堿性磷酸酶－1 (Akp1)檢測組織為腎臟，酯酶－1(Es1)檢測組織為血清。結論建立了雞生化標記檢測方法，并對BWEL－SPF雞群和Line－22雞群進行了分析，發(fā)現(xiàn)都存在多態(tài)性。

SPF雞;生化標記位點;乙酸纖維板電泳法

無特定病原體(specific pathogen－free，SPF)雞是指排除了特定病原體的一類雞，屬于實驗動物范疇，SPF雞及雞胚是動物病毒學、禽病學、生命科學等研究的重要實驗材料，也是禽流感疫苗、偽狂犬病疫苗、麻疹疫苗等生物制品生產(chǎn)的主要原材料，其遺傳學背景直接關系到病毒的復制能力、疫苗的產(chǎn)量以及對禽病的敏感性等，是必須考慮的一個重要生物學參數(shù)。

生化基因位點的編碼產(chǎn)物同工酶是生物體內(nèi)代謝過程中非常重要的調(diào)節(jié)酶類，具有多態(tài)性和共顯性，能直接反映蛋白質(zhì)水平的差異，在遺傳育種、種群結構分析、分類及進化等研究中具有獨特的意義。本研究利用乙酸纖維素板，參照《實驗動物近交系小鼠、大鼠生化標記檢測方法》［1］GB/T 14927.1－2001，摸索了針對雞的同工酶檢測方法，并對本單位保存的BWEL雞群和Line－22雞群等品系進行了檢測。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

BWEL－SPF雞群是我國唯一自主培育凈化的一個SPF雞品系，已封閉飼養(yǎng)15個世代。Line－22雞是另一個封閉群，已繁育3個世代。1日齡雌性BWEL－SPF雞5羽，1日齡Line－22雞群K2家系雌性5羽，由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心【SCXK(黑)2006－2009】提供。

1.2 儀器設備與試劑

DYY－6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、電泳微量點樣器和醋酸纖維板購于北京六一儀器廠，實驗動物小鼠遺傳檢測試劑盒購自中國藥品生物制品檢定所(批號:0407)，檢測所用生化試劑均為分析純。

1.3 組織樣品的制備

將雛雞心臟采血，分別制備含5%檸檬酸鈉的抗凝血和不含抗凝劑的全血。將抗凝血離心，5000 r/m in，離心5 m in，棄上清。在細胞壓積內(nèi)加入4倍體積的蒸餾水，劇烈震蕩1 min，制備溶血素。另取部分肝臟、肺臟和腎臟，分別在研缽中加石英砂研磨，在1.5 m L的EP管中稱重，加2倍(體積/重量)蒸餾水勻漿，4℃12 000 r/m in，離心10 m in。上清在－20℃?zhèn)浯妗?/p>

1.4 同工酶在不同組織中表達情況的檢測

參照國家標準《實驗動物近交系小鼠、大鼠生化標記檢測方法》［1］制定的電泳和顯色方法，分別對所有被檢組織中的堿性磷酸酶－1(Akp1)、酯酶－1 (Es1)、異檸檬酸脫氫酶－1(Idh1)、蘋果酸酶－1 (Mod1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Trf)、碳酸酐酶－2(Car2)和血紅蛋白－β鏈(Hbb)等7種同工酶的表達情況進行了檢測。

2 結果

2.1 Akp1表達情況的檢測

顯色結果顯示，在肺、肝、腎和血液組織中，均能出現(xiàn)一條帶(圖略)，但腎組織中的條帶較清晰，被檢BWEL雞之間和Line－22雞之間，電泳速率存在差異，如圖1所示(彩插12)。

2.2 Es1表達情況的檢測

顯色結果表明，Es1在血清中出現(xiàn)一條帶，相對于Line－22－K2帶型一致，BWEL－SPF雞群個體之間的泳動速度有差異，如圖2所示(彩插12)。

2.3 Idh1和M od1表達情況的檢測

Idh1和Mod1采用相同的顯色條件，結果表明，腎臟中出現(xiàn)較清晰的2條帶，BWEL雞群個體間帶型一致，而Line－22－K2的第5個個體(泳道10)表現(xiàn)為慢帶，如圖3所示(彩插12)。

2.4 Tr f表達情況的檢測

Trf屬于血清蛋白酶，但在肺、肝、腎、脾、心臟和溶血素等各組織中都有深淺、大小不同的條帶(圖略)，但帶型不同:血清中存在多態(tài)現(xiàn)象，多數(shù)為3條帶，少量存在4條帶;在溶血素中只出現(xiàn)2條帶，且與血清中的2條快帶位置一致;而在肺臟中均只表達1條帶，在BWEL－SPF雞中出現(xiàn)個體差異，Line－22－K2表現(xiàn)一致。如圖4所示(彩插12)。

2.5 Car2表達情況的檢測

Car2為紅細胞酶，通常采用溶血素進行檢測。顯色結果發(fā)現(xiàn)，在雞的多種組織中都出現(xiàn)了條帶，而且含量較多，但帶型不同。在肝臟中多達5條以上，存在不少于4條帶，但肉眼觀察條帶接近，帶型相似。在溶血素中可以清晰判斷的有2條帶，且品系間無明顯差異。如圖5所示(彩插12)。

2.6 Hbb表達情況的檢測

染色結果表明，在溶血素組織中可以明顯看到1條帶，品系間無差異，如圖6所示(彩插12)。

3 討論

目前國內(nèi)外對雞的生化標記位點的檢測多利用血漿蛋白酶進行檢測，如利用Akp、Trf、Es1、血清酯酶［2－9］等，用于品種遺傳學背景的比較［10］，或者進行多態(tài)性的分析。但是上述研究都只利用血液組織進行了分析，使適用的同工酶位點有限，造成了獲得生物學信息的局限。

本研究中我們首先利用Akp1、Car2、Trf、Es1、Idh1、Mod1、Hbb、Gpd1和Es3等9個生化標記位點對雞不同組織中的表達情況進行了摸索，結果發(fā)現(xiàn)Gpd1和Es3在各組織中都不能形成清晰的帶型，而只有Hbb、Trf、Car2、Idh1、Es1、Mod1和Akp1等7種同工酶出現(xiàn)穩(wěn)定的帶型，具有較好的重復性，所以最終選定該7個位點，建立同工酶檢測方法。在進行組織勻漿時，首先選擇了超聲破碎的方法，效果比較好，使組織中的同工酶較徹底的釋放出來，但破碎過程中產(chǎn)熱容易使酶失活，所以最終選擇研磨加遇冷蒸餾水的方式制備組織勻漿。

Akp1雖然在各種被檢組織上均出現(xiàn)條帶，而且在血清樣品中條帶較清晰，但在腎組織中的含量最高，因此選擇腎臟檢測Akp1位點;Idh1和Mod1在腎臟樣品中含量很高，經(jīng)過超聲破碎的樣品有明顯的兩條帶;Es3位點顯色結果不清晰，沒有明顯的帶型，不能作為檢測項目;Trf為血清蛋白，雖然從肺、血清和溶血素樣品中都能分辨出條帶，但在血清中帶型最清晰，因此選擇血清作為檢測Trf的組織來源。

根據(jù)建立的生化基因位點檢測方法，對BWELSPF雞群和Line－22雞群K2家系進行了多態(tài)性的初步檢測，結果發(fā)現(xiàn)BWEL－SPF雞群在Trf、Es1和Akp1存在帶型差異，Line－22雞群在Idh1、Mod1和Akp1存在差異，表明2個雞群的遺傳學背景都存在一定程度的多態(tài)性，這也符合封閉群實驗動物的遺傳特點要求。

雖然本研究建立的生化標記位點檢測方法對SPF雞群的遺傳結構分析提供了一定依據(jù)，但由于該方法在敏感性和特異性上的不足，還難以對實驗禽類進行更精確的多態(tài)性分析。有關分子水平的遺傳學檢測方法的建立，將在后續(xù)研究中進行報道。

(本文圖1～6見彩插12。)

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Estab lishm ent of a M onitoring M ethod of Biochem ical M arkers in BW EL-SPF Chicken Popu lations

HAN Ling－xia1，GAO Peng－fei1，2，LIU Xiao－lei1，SI Chang－de1，QU Lian－dong1
(1.Laboratory Animal Center of Harbin Veterinary Research Institute，CAAS，Harbin 150001，China;
2.College of Animal Science and Technology，Shanxi Agriculture University，Taigu 030801)

ObjectiveTo establish a detection method of biochemical markers for genetic monitoring of SPF chickens.M ethod According to national standard“Laboratory Animal－Genetic Monitoring:Methods for Biochemical Markers of Inbred Mice and Rats”，cellulose acetate membrane electrophoresis was used to develop the monitoring method..ResultsIt was showed that 7 types of isozymes could be used to monitor the chicken populations，hemoglobin β－chain (Hbb)should be tested in the hemolysin，transferrin(Trf)in the lung，carbonic anhydrase－2(Car2)in the liver or hemolysin，isocitrate dehydorgenase－1(Idh1)，malic enzyme－1(Mod1)and alkaline phosohatase(Akp1)in the kidney，and esterase－1(Es1)in the serum.Conlusions A genetically detection method of biochem ical markers for chickens has been established，and polymorphisms are identified in the BWEL－SPF chicken and Line－22－k2 chicken populations.

SPF chicken;Biochemical marker;Polymorphism;Cellulose acetate membrane electrophoresis

R－394

A

1005－4847(2010)02－0161－03

2009－07－13

黑龍江省科技攻關項目(PC06S17);黑龍江省自然科學基金項目(C2007－06)。

韓凌霞(1971－)，女，博士，從事實驗動物學研究。Email:hlx1993@126.com