豬傳染性胃腸炎疫苗的研究進(jìn)展

吳 鋒 黃毓茂

豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由冠狀病毒科冠狀病毒屬豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引發(fā)的一種高度接觸傳染性的病毒性疾病。臨床上主要以豬的嚴(yán)重嘔吐、腹瀉和脫水為特征，各年齡段的豬均可發(fā)病，尤其2周齡內(nèi)的仔豬，死亡率可高達(dá)100%。自1946年該病在美國(guó)豬群中爆發(fā)以來(lái)，給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1977年法國(guó)僅由于應(yīng)付TGE的暴發(fā)就耗用了1000萬(wàn)美元的防治費(fèi)用，現(xiàn)在許多歐洲國(guó)家接近100%的豬群還是TGE陽(yáng)性，TGE同樣給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此該病的有效防控已成為世界養(yǎng)豬業(yè)關(guān)注的頭等大事。目前，控制本病主要有兩種方法：一是在少數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家，在有較高生產(chǎn)技術(shù)和嚴(yán)格的獸醫(yī)衛(wèi)生規(guī)范相配合的條件下，培育清凈豬群，但是不能在多數(shù)國(guó)家推廣；二是接種疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防。

人們自發(fā)現(xiàn)本病就開(kāi)始研究免疫控制技術(shù)，大致經(jīng)歷了人工感染強(qiáng)毒、滅活苗、弱毒活疫苗和基因工程疫苗四個(gè)階段。在很長(zhǎng)一段時(shí)間里，許多國(guó)家都采用母豬人工感染強(qiáng)毒的方法，即在母豬分娩前2～3周對(duì)其進(jìn)行口服感染，使其初乳中含有大量的分泌型IgA、IgG，這種免疫方法對(duì)仔豬能產(chǎn)生良好的免疫效果，但易使仔豬發(fā)病，有擴(kuò)大蔓延TGE的潛在危險(xiǎn)，因此現(xiàn)在很少應(yīng)用。目前世界上主要采用弱毒苗、滅活苗或二者聯(lián)合疫苗進(jìn)行預(yù)防，即在懷孕母豬產(chǎn)前20～40d，經(jīng)口、鼻和乳腺接種弱毒疫苗，使母豬產(chǎn)生包括lgA、lgG和IgM在內(nèi)的乳汁抗體，或在仔豬出生后，用無(wú)病原性的弱毒疫苗口服免疫；生產(chǎn)上也用滅活疫苗，但其免疫劑量較大；雖然這種方法對(duì)仔豬能產(chǎn)生理想的保護(hù)效果，但也存在一定缺陷，如滅活苗安全性雖好，但免疫效果差，需添加佐劑，多次注射；而弱毒苗免疫原性雖優(yōu)于滅活苗，但其毒性大，存在潛伏感染、排毒、散毒、毒力返祖等現(xiàn)象；同時(shí)，由于流行毒株毒力和生物學(xué)特性的變異性，常規(guī)疫苗往往不能抵抗自然流行病毒株的攻擊。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們?cè)趶V泛延用滅活苗或弱毒活苗等常規(guī)疫苗的同時(shí)，基因工程疫苗的研制也越來(lái)越多，并顯示出良好的優(yōu)越性，因此一種安全、高效的基因工程疫苗的開(kāi)發(fā)已成為當(dāng)務(wù)之急。

1.常規(guī)疫苗

1.1 滅活疫苗

目前國(guó)內(nèi)外均有多種商業(yè)疫苗，曹軍平等利用在某豬場(chǎng)分離到一株，TGEV地方毒株經(jīng)凍融、紗布過(guò)濾提取濾液，加甲醛滅活，用汕乳劑乳化制成組織滅活苗，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室和野外試驗(yàn)，結(jié)果安全性可靠，保護(hù)率較高；賈華強(qiáng)通過(guò)制備TGE乳化和氫氧化鋁吸附滅活細(xì)胞疫苗，進(jìn)行臨床四個(gè)豬場(chǎng)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)仔豬存活率能達(dá)到80%以上。但滅活苗免疫妊娠母豬往往不能刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的乳汁免疫，故臨床上往往和弱毒苗一起使用，才可以產(chǎn)生較好的保護(hù)效果。

1.2 弱毒疫苗

弱毒疫苗近來(lái)沒(méi)得到深入研究，還是局限于美國(guó)的TGE-Vac株、匈牙利的CKP株和日本的TO-163株等。Moxley等通過(guò)應(yīng)用TGE弱毒活苗肌注免疫妊娠母豬，產(chǎn)生的母源抗體可以使仔豬對(duì)于TGE的耐過(guò)率明顯高于滅活苗。國(guó)外的學(xué)者仍采用Ay-naud的方法將TGEV突變株188-SG致弱后分別通過(guò)口服、肌肉注射、眼結(jié)膜途徑免疫妊娠母豬，從而使哺乳仔豬得到保護(hù)。我國(guó)的TGE弱毒株是在原代胎豬腎細(xì)胞上經(jīng)165次傳代致弱，其間又經(jīng)5次克隆純化篩選獲得，采用的疫苗接種途徑還是采用鼻粘膜和肌肉注射。王明等將TGE弱毒苗后海穴主動(dòng)免疫母豬，結(jié)果對(duì)所產(chǎn)仔豬產(chǎn)生了很好保護(hù)效果，用小劑量TCE弱毒苗后海穴免疫3 d齡仔豬也取得了較好的免疫效果。但上述弱毒苗都必須經(jīng)過(guò)多次免疫才能起到良好的免疫效果。弱毒苗能刺激粘膜免疫，肌肉注射產(chǎn)生抗體快、水平高，歐美現(xiàn)使用的疫苗主要是弱毒苗。

弱毒疫苗對(duì)預(yù)防該病的發(fā)生起到了重要的作用，但同樣存在其他弱毒疫苗所存在的易返祖、有潛在感染危險(xiǎn)等缺陷。

1．3 聯(lián)苗

鑒于單一滅活苗和弱毒疫苗的缺陷，在臨床上多采用聯(lián)苗進(jìn)行豬傳染性胃腸炎等病毒性腹瀉病的預(yù)防。姚新軍等應(yīng)用TGE-PED二聯(lián)滅活苗，后海穴注射預(yù)防TGE，母豬發(fā)病率為3%，2周齡內(nèi)哺乳仔豬發(fā)病率為0.7%，并且經(jīng)治療后無(wú)一頭死亡。佟有恩等用TGE及PED克隆化弱毒株，以1∶1配比制成TGE-PED二聯(lián)弱毒疫苗，免疫母豬和仔豬，被動(dòng)免疫與主動(dòng)免疫保護(hù)率分別為97.7%和98%，田間試驗(yàn)保護(hù)率為95%～98%，對(duì)緊急預(yù)防接種的防制效果更為明顯。上海農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所錢(qián)永清等采用豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒細(xì)胞培養(yǎng)物制備了三聯(lián)滅活疫苗。實(shí)驗(yàn)室免疫結(jié)果表明，育肥豬和妊娠母豬免疫后15d達(dá)到較高的免疫水平，免疫有效期超過(guò)6個(gè)月，妊娠母豬所產(chǎn)仔豬可獲得高水平的被動(dòng)免疫保護(hù)。試驗(yàn)場(chǎng)應(yīng)用的結(jié)果表明，母豬保護(hù)率達(dá)98%，仔豬被動(dòng)免疫保護(hù)率達(dá)93%。

2.基因工程疫苗

盡管常規(guī)疫苗在預(yù)防和控制TGE的過(guò)程中仍發(fā)揮著重要作用，但隨著分子生物學(xué)技術(shù)和的飛速發(fā)展，基因工程疫苗以低成本、生產(chǎn)簡(jiǎn)單、存儲(chǔ)方便等強(qiáng)勁的優(yōu)勢(shì)受到越來(lái)越多人的矚目，各種TGEV基因工程疫苗的研究也得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。S糖蛋白是唯一能誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生和提供免疫保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)蛋白，因此作為S蛋白分子基礎(chǔ)的S基因就成為基因工程研究的重點(diǎn)。

2．1 亞單位疫苗

亞單位疫苗畔，含有特殊的高分子，它將保護(hù)性抗原基因?qū)爰?xì)胞，高效表達(dá)，加以佐劑而成，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抵抗病原體的免疫保護(hù)作用。由于豬傳染性胃腸炎冠狀病毒的S蛋白具有良好的免疫原性和在腸道內(nèi)較強(qiáng)的抗降解能力，因此它成為發(fā)展哺乳動(dòng)物腸道病原體口服疫苗的一個(gè)非常好的模型，Codet和Shoup等用桿狀病毒為載體在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)S基因，表達(dá)產(chǎn)物與弗氏完全佐劑配制成疫苗，免疫35d齡路易斯鼠，能夠產(chǎn)生高效價(jià)的中和抗體；12d后，鼠血清中和試驗(yàn)的效價(jià)達(dá)1∶2500；用表達(dá)的S糖蛋白作為弱毒苗免疫妊娠母豬后的加強(qiáng)免疫，可顯著提高母豬血清和初乳的抗體水平，其對(duì)仔豬的保護(hù)率比弱毒苗兩次免疫還高14%，但S蛋白亞單位苗單獨(dú)免疫效果不佳。Tuboly等將TGEVS基因的7個(gè)片段和全長(zhǎng)S基因的cDNA片段克隆在桿狀病毒載體中表達(dá)。重組病毒免疫乳豬后，發(fā)現(xiàn)只有結(jié)構(gòu)中包含抗原位點(diǎn)A的S糖蛋白才能產(chǎn)生高滴度的中和抗體。

2．2 基因缺失或突變疫苗

基因缺失或突變疫苗是通過(guò)人為的方法將與病原菌或病毒毒力相關(guān)的基因全部或部分刪除，或發(fā)生突變而使其毒力減弱構(gòu)建成的活疫苗，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)力。Ballestems等嘗試改變TGEV的S基因214位和655位2個(gè)堿基，制成重組疫苗，進(jìn)行呼吸道和腸道組織感染，證明僅改變655位堿基，就可對(duì)呼吸道TGEV產(chǎn)生特異性反應(yīng)，而219位堿基的改變則導(dǎo)致TGEV腸嗜性的丟失。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，S基因219位堿基附近存在TGEV受體結(jié)合部位。Riffauh等研究發(fā)現(xiàn)缺失S基因的TGEV能夠誘導(dǎo)α-干擾素分泌，由于缺失S基因，因此不會(huì)產(chǎn)生任何毒性，這為研制TGEV基因缺失疫苗奠定了一定的基礎(chǔ)。

2．3 重組活載體疫苗

此類(lèi)疫苗以某種非致病性病毒為載體攜帶并表達(dá)TGEV的保護(hù)性免疫抗原基因，即將一種病原免疫相關(guān)抗原整合到另一種載體基因組DNA的復(fù)制非必需片斷中構(gòu)成。目前，TGEV重組病毒疫苗的研究比較多，且證明疫苗效果很不錯(cuò)。SemMou等用減毒沙門(mén)氏菌為載體表達(dá)TGEV的S基因和S基因片段，由于表達(dá)的蛋白缺少糖基化依賴(lài)的構(gòu)象免疫決定簇A，接種鼠、兔、豬后，均產(chǎn)生低水平的或者沒(méi)有產(chǎn)生中和抗體，將表達(dá)的蛋白包被糖基化依賴(lài)的抗原決定簇(位點(diǎn)A，B)，接種動(dòng)物則能夠產(chǎn)生各種水平的中和抗體和保護(hù)力，楊恒”’等也通過(guò)減毒沙門(mén)氏菌為載體，成功構(gòu)建了攜帶TGEVDNA疫苗的活載體口服疫苗，并顯示出良好的免疫原性和安全性。Britton和Torres等將S基因插入到痘病毒和腺病毒載體中，然后用這兩種重組的痘病毒和腺病毒免疫動(dòng)物，均可誘發(fā)抗TGEVS蛋白的中和抗體。近年來(lái)，乳酸菌表達(dá)載體系統(tǒng)的研究已顯示優(yōu)越性，唐麗杰等以乳酸乳球菌為載體表達(dá)了TGEV的S基因片段，口服免疫BALB／c小鼠，能夠產(chǎn)生明顯的slgA抗體。重組活載體疫苗雖有一定的免疫保護(hù)作用，但造價(jià)比較高，不利于廣泛的推廣應(yīng)用。

2．4 合成肽疫苗

合成肽疫苗是根據(jù)免疫抗原表位的氨基酸合成的抗原決定基小肽制作的疫苗。一般是從蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)并結(jié)合單克隆抗體的分析，推導(dǎo)出蛋白質(zhì)免疫主要抗原表位的氨基酸順序，然后用基因工程技術(shù)或化學(xué)方法制備類(lèi)似天然抗原決定基的小肽作為抗原。SemMou等將S蛋白的373～398片段氨基酸(含D抗原位點(diǎn))組成的肽合成后克隆到大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒索B亞基的(LT-B)3，端閱讀框中，轉(zhuǎn)染鼠傷寒沙門(mén)氏菌，用表達(dá)產(chǎn)物免疫兔子，產(chǎn)生抗TGEV的中和抗體。Anton等通過(guò)試驗(yàn)表明，將TGEV S糖蛋白在B細(xì)胞上的2種抗原決定部位(分別為C抗原決定部位363～371氨基酸序列和A抗原位點(diǎn)522～531位氨基酸區(qū)段)分別克隆到E.coli細(xì)胞表面CS31A纖維的CipG區(qū)進(jìn)行表達(dá)，重組嵌合體免疫小鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生邊緣性TGEV中和抗體反應(yīng)，因此合成肽疫苗應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐完全是可行的。

2．5 轉(zhuǎn)基因植物疫苗

轉(zhuǎn)基因植物疫苗是通過(guò)植物基因工程技術(shù)與機(jī)體免疫機(jī)理相結(jié)合的原理，利用農(nóng)桿菌或基因槍等技術(shù)，將免疫原性基因?qū)胫参镏?，利用植物作為生物反?yīng)器大量表達(dá)有免疫原性的外源蛋白作為疫苗，或者把轉(zhuǎn)基因植物直接加工飼喂動(dòng)物，使其表達(dá)的抗原呈遞到動(dòng)物的腸道淋巴組織，被其表面特異受體識(shí)別，產(chǎn)生粘膜免疫和體液免疫反應(yīng)。由于植物疫苗具有生產(chǎn)、貯運(yùn)簡(jiǎn)單，無(wú)污染，無(wú)副作用等優(yōu)點(diǎn)，因此利用植物來(lái)表達(dá)抗原生產(chǎn)疫苗越來(lái)越受關(guān)注。1998年，Gomez將TGEV的S基因克隆到花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子下游，轉(zhuǎn)化到擬南芥的種子中，成功地構(gòu)建了TGEV轉(zhuǎn)基因植物疫苗，用這種植物飼喂豬，結(jié)果產(chǎn)生了中和抗體和免疫保護(hù)作用。2000年，Gomez等將TGEV的S糖蛋白的N端結(jié)構(gòu)域(含主要抗原編碼蛋白)轉(zhuǎn)入到馬鈴薯中制成轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，把這種馬鈴薯塊莖直接喂給小鼠，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了抗S蛋白的特異性血清抗體。Tuboty等也報(bào)道了植物表達(dá)，TGEVS蛋白免疫原性的研究?，F(xiàn)在豬傳染性胃腸炎冠狀病毒的S蛋白已經(jīng)被轉(zhuǎn)入煙草、馬鈴薯、紅豆花葉、玉米、擬南介等植物中，有的已經(jīng)進(jìn)行動(dòng)物飼喂試驗(yàn)，并檢測(cè)到抗體的產(chǎn)生。這些研究表明用植物表達(dá)TGEV的S蛋白具有經(jīng)口免疫原性，TGEV的轉(zhuǎn)基因植物可食用疫苗有廣闊的發(fā)展前景。

3.展望

豬傳染性胃腸炎是一種腸道傳染病，病毒感染具有明顯的腸嗜性，通過(guò)口服疫苗免疫，激發(fā)腸道粘膜免疫反應(yīng)特別是sIgA的產(chǎn)生是預(yù)防該病較為理想的途徑。也可通過(guò)應(yīng)用輔助粘膜傳遞系統(tǒng)如免疫刺激復(fù)合物，生物可分解的微球體或感染性重組TGEV克隆來(lái)加強(qiáng)TGEV的免疫原性和減少致病性，進(jìn)一步改進(jìn)TGEV疫苗。就目前的研究發(fā)展來(lái)看，盡管常規(guī)疫苗有其固有的缺陷，但在市場(chǎng)上仍占有很大的比例，使用傳統(tǒng)的方法加強(qiáng)疫苗的管理，更進(jìn)一步研究免疫原性好的制苗菌(毒)株，改進(jìn)生產(chǎn)工藝及自動(dòng)控制培養(yǎng)抗原的方法，提高細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，提高傳統(tǒng)疫苗質(zhì)量，仍是疫苗研究的一個(gè)重要方向。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和免疫學(xué)的進(jìn)展，基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)的應(yīng)用，使TGEV疫苗的研究和開(kāi)發(fā)也得到迅猛發(fā)展，并在很多領(lǐng)域內(nèi)取得進(jìn)展和成果，為應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，生產(chǎn)實(shí)用的新一代疫苗的可能性已大大增加。截至目前，轉(zhuǎn)基因植物疫苗和重組載體活疫苗都在研究之中，而核酸疫苗是基因疫苗研究的熱點(diǎn)，乳酸桿菌疫苗由于其益生菌的特性也逐漸被重視起來(lái)。盡管基因工程疫苗已顯示出良好的免疫原性，但大都處于起步階段，還有許多的問(wèn)題急待解決，例如采用的免疫方案、免疫機(jī)制研究、安全性等。隨著研究的進(jìn)一步發(fā)展，上述問(wèn)題終將解決，TGEV基因工程活載體疫苗、TGE和豬流行性腹瀉(PED)基因工程多價(jià)疫苗及轉(zhuǎn)基因植物可食疫苗，必將有廣闊的前景。我們可以預(yù)測(cè)，隨著基因診斷、基因治療和基因免疫等的研究的發(fā)展，人類(lèi)將走向一個(gè)預(yù)防和治療疾病的新紀(jì)元。