牛病毒性腹瀉疫苗的研究進展

王慧慧 時 坤 于本峰 刁 燕 杜 銳

牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV)是黃病毒科，瘟病毒屬的成員，可引起多種動物呈多臨床表現(xiàn)的病毒性腹瀉-粘膜病，主要表現(xiàn)為腹瀉，急、慢性粘膜病，母畜流產(chǎn)、不孕，產(chǎn)死胎、木乃伊胎或畸形胎等。自1946年Olafson等首次報道牛病毒性腹瀉-粘膜病以來，該病呈世界性分布，廣泛存在于美國、澳大利亞、英國、新西蘭等畜牧業(yè)發(fā)達國家。我國目前已有20多個省市自治區(qū)存在該病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。國際獸疫局(OIE)將其定為B類傳染病，我國在進出口檢疫中也把它定為二類傳染病。國外對該病主要采取疫苗接種和淘汰持續(xù)感染病畜的綜合防治措施。國內(nèi)對BVDV疫苗的研究相對滯后，目前國內(nèi)還沒有正式的國產(chǎn)BVDV疫苗。因此，研制一種安全有效的BVDV疫苗是當前防治該病的主要方向。

1.常規(guī)疫苗

在疫苗發(fā)展全盛時期的60年代研制了第一批BVDV疫苗，這是一種相對簡單的全毒疫苗，事實上它與現(xiàn)在常規(guī)應(yīng)用的BVDV疫苗并沒有多大差異。目前，商品化BVDV疫苗主要是利用一些常規(guī)的BVDV研究毒株，如NADL株、Singer株、Oregon C24V株和NY-1株等細胞培養(yǎng)物而產(chǎn)生的弱毒或滅活苗。一般來說，這兩種疫苗對同源毒株或抗原差異較小的毒株的保護是有效的，但對于感染了不同抗原性BVDV毒株的畜群來說，使用這類疫苗就得不到有效的保護。Makoschey等對1型BVDV(Bloviklis BVD)滅活苗用于臨床2型BVDV感染的免疫效果進行了研究，結(jié)果表明：Bloviklis BVD滅活苗只能夠給異源的2型BVDV感染提供一定的交叉保護。

1.1 弱毒苗

弱毒疫苗存在一個安全性的問題。專家們已有共識，弱毒苗比死苗或滅活苗的危險性更大，因為弱毒苗需要考慮其恢復致病性的潛力。弱化病毒是子宮感染和免疫抑制的一個潛在因素，已證實有些粘膜病的發(fā)生和牛群免疫BVD弱毒疫苗有關(guān)，這種危險性在某種程度上已取代了它的優(yōu)點。其次，有的專家認為，BVD活疫苗免疫母畜后可能不出現(xiàn)臨床癥狀，但少量的BVDV卻能引起胎兒損傷，或持續(xù)感染。因此，一般要求對懷孕牛避免使用弱毒苗。另外，這些疫苗是用牛源細胞培養(yǎng)物制備的，因此有可能將其他的生物介質(zhì)作為污染源帶入動物體內(nèi)。

當然，活疫苗還是有一定的免疫保護作用，因此國內(nèi)外也有學者不斷嘗試改進活疫苗的質(zhì)量，以期發(fā)揮其應(yīng)有的免疫效力。20世紀80年代初(中國獸藥監(jiān)察所)有人用Oregon C24V標準毒株試制了BVD弱毒凍干苗，試用后雖能產(chǎn)生抗BVD感染的保護性中和抗體，但注射疫苗后發(fā)現(xiàn)有白細胞數(shù)減少，一過性熱反應(yīng)等現(xiàn)象，故最終未申請投入批量生產(chǎn)。閻高峰等試制了BVD O系弱毒凍干苗，并在青海省玉樹、稱多和則庫3個疫病發(fā)生嚴重的縣試用，證明對預防BVD有較好的效果，但也因成本和其他原因未能申請批量生產(chǎn)。

1.2 豬瘟兔化弱毒苗

豬瘟兔化弱毒苗對預防BVD也有一定的作用。20世紀80年代初，首次證明了牦牛粘膜病的存在之后，曾用注射豬瘟弱毒苗來預防牦牛粘膜病。共注射270頭牦牛，注苗半年后測定血清中和抗體效價與粘膜病弱毒苗效價相近，且發(fā)現(xiàn)牦牛群中流行的粘 膜病得到了良好控制。馮彥昌用豬瘟兔化弱毒苗免疫牛，經(jīng)過4年的應(yīng)用證明取得了良好的預防效果。紀金春等用豬瘟兔化弱毒苗對青海省某地4萬多頭牦牛進行免疫接種，結(jié)果未免疫豬瘟苗的牦牛群死亡率達3.28%，而免疫的牦牛群死亡率為0.27%，兩組差異顯著?？梢娪秘i瘟弱毒苗預防牛病毒性腹瀉病有一定的效果，可以作為預防BVD的措施之一。但國內(nèi)使用的豬瘟疫苗是弱毒，接種于牛體后是否會發(fā)生抗原變異有待研究，在尚未獲得確切的依據(jù)之前，應(yīng)慎用。

1.3 滅活苗

滅活苗的安全性較弱毒苗有很大優(yōu)勢，因此，國內(nèi)外對不同滅活方法的研究十分活躍。已經(jīng)證實，用福爾馬林滅活的BVDV滅活苗在一定程度上對胎兒具有保護力。Roeder P L等用氮丙啶(Aziridine)滅活的疫苗應(yīng)用到牛體后，未見感染等不良反應(yīng)。我國學者應(yīng)用二乙烯亞氨滅活氫氧化鋁作為滅活苗的佐劑，也證明對胎兒具有一定保護力。

但是由于滅活苗免疫原性較差，很多學者對它在胎兒保護的有效性方面存在質(zhì)疑，而且正如上文所提及的，滅活苗與弱毒苗一樣，對抗原性不同的BVDV的交叉反應(yīng)性較弱。因此，研究者們?nèi)孕枭钊胙芯?，選擇出免疫原性好、抗原譜廣的毒株作為制苗種毒，以提，高疫苗的免疫效果。

1.4 聯(lián)合疫苗

有報道表明，滅活苗聯(lián)合弱毒苗應(yīng)用可提高免疫接種的效果。德國Frey等對8只母牛用BVD活苗免疫接種4周之后，再將這些母牛在交配期內(nèi)接種一或兩次滅活疫苗，兩次接種間隔4周，在母牛妊娠60～80 d內(nèi)用強毒株攻擊，并進行病毒分離和抗體檢測，結(jié)果表明，新生小牛在病毒分離和抗體檢測方面均為陰性，說明后代沒有感染BVDV，從而證實使用滅活苗有利于提高BVD活苗免疫接種的安全性。這樣聯(lián)合使用，一方面可提高滅活疫—苗的免疫效力，另一方面可提高弱毒疫苗的安全性，因此，滅活苗和弱毒苗聯(lián)合使用也是免疫預防該病的有效途徑之一。

2.新型疫苗

鑒于傳統(tǒng)疫苗存在諸多不足，促使人們尋求一種更加安全有效的BVDV疫苗。目前國外很多學者已經(jīng)從多種途徑進行BVDV新型疫苗的研制，這其中包括重組活載體疫苗、亞單位疫苗和DNA疫苗，以及含多種抗原的傳統(tǒng)疫苗。

2.1 亞單位疫苗

分子生物學技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，為研制和生產(chǎn)BVDV亞單位疫苗提供了廣闊的前景。如利用BVDV糖蛋白E2(gp53)研制成的E2亞單位疫苗，其機理是將編碼E2基因的質(zhì)粒DNA直接注入動物體內(nèi)，在機體內(nèi)翻譯表達，產(chǎn)生中和抗體，從而對動物具有良好的保護作用。近年來，國外許多學者進行了E2亞單位疫苗的研究。丹麥在ISCOM技術(shù)的基礎(chǔ)上研制出新的牛病毒性腹瀉亞單位疫苗。該BVD亞單位疫苗能產(chǎn)生高水平的中和抗體，不僅能抵抗同源毒株的感染，而對丹麥的野外分離株的感染也有保護作用。另外，該苗比一般亞單位疫苗的生產(chǎn)工藝簡單，不需要精密儀器，易于推廣應(yīng)用。Bruschke等針對4種抗原性不同的毒株，構(gòu)建了多價的E2亞單位疫苗，屬于Ia、Ib和基因Ⅱ型，該疫苗對同源毒株能提供部分保護。Wang等證明了融合C3d的E2亞單位疫苗有提高疫苗免疫效果的潛在能力。

2.2 DNA疫苗

DNA疫苗因其具有諸多優(yōu)點而被認為是疫苗研究領(lǐng)域里的新紀元。BVDVE2DNA疫苗是近年來BVDV免疫研究的熱點。Nobiron等進行了E2DNA疫苗和使用IL-2；GMCSF作為免疫佐劑的E2DNA疫苗免疫效力的研究，結(jié)果所有小鼠免疫后都產(chǎn)生了較強的體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答，其中使用細胞因子作為佐劑能加強免疫應(yīng)答。Harpin等通過對小鼠肌肉或皮內(nèi)注射含有BVDVE2基因的質(zhì)粒后，產(chǎn)生的中和抗體能持續(xù)6個月。Harpin等將E2DNA裸體疫苗(N-DNA)和脂質(zhì)體包裹的疫苗(L-DNA)分別注射牛，兩組都產(chǎn)生針對疫苗的中和抗體，N-DNA組免疫反應(yīng)較弱，16周后用BVDV-I株攻毒，N-DNA具一定保護作用，L-DNA則沒有。攻毒后可激發(fā)免疫牛產(chǎn)生針對BVDV-I和BVDV-Ⅱ中和抗體。Nobiron等就E2 DNA疫苗對牛的免疫效力試驗，免疫組15頭牛攻毒后，13頭可以檢測到中和抗體，其中8頭牛白細胞中能分離到病毒，而對照組全部可以分離到病毒，表明E2DNA疫苗對牛有一定的保護力。這些都證明了DNA疫苗具有很大的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。

此外，BVDV全長的感染性克隆已經(jīng)構(gòu)建成功，這使研究者們可以通過反向遺傳技術(shù)來研制致弱的BVDV毒株，最終將研制出一種安全高效的減毒活疫苗。BVDV非翻譯區(qū)5’-UTR缺失，可用做BVDV弱毒活疫苗，接種免疫后可以產(chǎn)生高水平的BVDV中和抗體，保護動物不受同源毒株的攻擊，而且安全有效。國外還有學者進行了BVD可食用疫苗的研究，這也是一個值得探索的方向。

2.3 重組活載體疫苗

利用基因操作技術(shù)將BVDV E2基因插入到另一種病毒基因組中，使之高效表達重組蛋白的重組病毒已經(jīng)構(gòu)建成功，使用的載體包括水皰性口炎病毒、牛I型皰疹病毒、禽痘病毒、牛3型腺病毒。Grigera等將E2基因克隆到水皰性口炎病毒中，重組病毒免疫小鼠后能顯著減少病毒感染癥狀，所產(chǎn)生的中和抗體在體內(nèi)能持續(xù)180 d。Kweon等將BVDV E2基因插入到牛皰疹病毒TK基因上，用重組病毒免疫牛后，產(chǎn)生的中和抗體能顯著減弱臨床癥狀的發(fā)生。Liang等報道，去掉E2蛋白的跨膜錨定區(qū)并導入牛皰疹病毒(BHV-1)的信號序列，可使E2蛋白大量表達，免疫小鼠后在其體內(nèi)能檢測到大量的IgG抗體。這一發(fā)現(xiàn)為BVDV基因疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

最近有報道，可將穿梭表達載體pMV261-E2轉(zhuǎn)化到卡介苗中，獲得重組卡介苗，說明牛病毒性腹瀉—粘膜病病毒E2基因可以成功地在卡介苗中表達。由于卡介苗(BCG)是預防結(jié)核病的有效制劑，集佐劑與抗原于一身。作為重組細菌活載體的rBCG比重組病毒活載體更容易開發(fā)，如生產(chǎn)工藝簡單、價廉，不需純化及后期處理，性質(zhì)穩(wěn)定易保存，可口服和注射兩用。因此，這是研制BVDV新型疫苗的一個新的探索方向。

3.小結(jié)

BVDV毒株變異性較高，防制工作困難較多，而我們使用BVDV疫苗已有30多年的歷史，常規(guī)疫苗中無論是弱毒苗還是滅活苗，沒有一個是絕對安全有效的。所以要從根本上解決防制問題，還需從分子生物學方面著手，研制BVD新型疫苗。從目前國內(nèi)外學者研究情況來看，新型疫苗在使用效果、安全性等方面都要優(yōu)于常規(guī)疫苗。

綜上所述，目前還沒有一種較理想的常規(guī)疫苗，新型疫苗也還存在許多問題有待解決，因此，牛病毒性腹瀉疫苗仍有廣闊的研究空間。這就迫切需要國內(nèi)外學者進行進一步的研究，優(yōu)化傳統(tǒng)的常規(guī)疫苗，探索新型疫苗。而據(jù)近年來相關(guān)的文獻報道表明，重組活載體疫苗由于其高效而具有高度特異性的優(yōu)點，已經(jīng)成為研制BVDV新型疫苗的一個熱點趨向。相信隨著預防獸醫(yī)學、動物免疫學及分子生物學的不斷發(fā)展，在不久的將來，人們能夠研制出一種高效、安全、廉價的牛病毒性腹瀉疫苗，最終達到控制甚至消滅牛病毒性腹瀉的目標。