定點突變提高里氏木霉木聚糖酶 (XYN II) 的穩(wěn)定性

韓承業(yè)，余世袁，歐陽嘉，李鑫，周娟，許艷

南京林業(yè)大學 林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室，南京 210037

定點突變提高里氏木霉木聚糖酶 (XYN II) 的穩(wěn)定性

韓承業(yè)，余世袁，歐陽嘉，李鑫，周娟，許艷

南京林業(yè)大學 林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室，南京 210037

通過定點突變的方法，在來源于里氏木霉Trichderma reesei的木聚糖酶XYN II的N-末端兩個β折疊片層間添加二硫鍵，以提高木聚糖酶的穩(wěn)定性。原酶XYN-OU和突變酶XYN-HA12 (T2C、T28C和S156F) 分別在畢赤酵母中分泌表達，突變酶與原酶純化后進行酶學性質(zhì)比較。結(jié)果表明：突變酶最適反應溫度由50℃提高到60℃；在70℃的半衰期由1 min提高到14 min；最適反應pH為5.0，與原酶保持一致，但是在50℃、30 min條件下的pH穩(wěn)定范圍由4.0~9.0擴展到3.0~10.0。對木聚糖酶分子改良的結(jié)果反映出在β片層間添加二硫鍵可以有效改善酶在較高溫度下三維結(jié)構(gòu)的剛性，提高熱穩(wěn)定性。

定點突變，木聚糖酶，熱穩(wěn)定性，里氏木霉

近年來，隨著木聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)的解析和人類對蛋白質(zhì)分子功效的認識不斷深入，對酶進行分子改良已成為可能。采用基因工程手段提高木聚糖酶穩(wěn)定性的研究得到不斷地發(fā)展。Stephens等[3]采用易錯PCR的定向進化手段挑選熱穩(wěn)定性更好的菌株，得到的耐熱菌株在70℃的半衰期由原始菌株的89 min提高到 215 min；Sriprang等[4]采用精氨酸取代Aspergillus niger BBC14405表面的絲氨酸/蘇氨酸，提高了酶的熱穩(wěn)定性。許多研究結(jié)果表明G/11家族木聚糖酶的 N-末端區(qū)域和二硫鍵的添加對于 G/11家族木聚糖酶的穩(wěn)定性起著很重要的作用。楊浩盟等[5]通過 N-末端氨基酸的點突變 (N13D和 S40E)替換將橄欖綠鏈霉菌 Streptomyces olivaceoviridis木聚糖酶熱穩(wěn)性提高了24.76%；Georis等[6]通過提高 N-末端芳香族氨基酸間的相互作用來增強Streptomyces的熱穩(wěn)性；Sun等[7]用耐熱性木聚糖酶TfxA的N-末端區(qū)域替換黑曲霉Aspergillus niger木聚糖酶A的N-末端相應區(qū)域，使其最適反應溫度提高 10℃；Wakarchuk等[8]在芽胞桿菌 Bacillus circulans木聚糖酶的 N-和 C-區(qū)域構(gòu)建了一個二硫鍵使該木聚糖酶熱穩(wěn)性提高大于 10℃；Jeong等[9]在脂肪嗜熱芽胞桿菌 Bacillus stearothermophilus No. 236木聚糖酶內(nèi)部構(gòu)建一個二硫鍵，使木聚糖酶XynA 的熱穩(wěn)性提高 5℃。Fenel等[10]在里氏木霉Trichoderma reesei XYN II的N-末端構(gòu)建一個二硫鍵，并延長C-末端使酶的最適溫度提高10℃，本研究受其啟發(fā)在酶的N-末端構(gòu)建二硫鍵，并通過156位點的突變大幅度地提高了酶活力。

來源于里氏木霉的木聚糖酶 XYN II是屬于G/11家族木聚糖酶，適合應用于生物漂白過程。重組木聚糖酶XYN II對麥草漿CEH的輔助漂白，在保證紙漿白度略有提高的前提下，可以降低氯化段有效氯使用量50%以上[11]。但熱穩(wěn)定性較差是它在應用中的不足。本研究針對上述問題，通過定點突變的方法在木聚糖酶的N-末端構(gòu)建了一個二硫鍵，以期提高XYN II的熱穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 菌種、質(zhì)粒

木聚糖酶基因xyn II由本實驗室從Trichoderma reesei中獲得并構(gòu)建在重組畢赤酵母表達載體pPIC9K-xyn II上[12]；菌株大腸桿菌Escherichia coli DH5α、載體 pPIC9K (Amp+，Kan+) 均由本實驗室保存；畢赤酵母菌株 GS115 (His?) 購自 Invitrogen公司。

1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌培養(yǎng)基 LB，畢赤酵母培養(yǎng)基 YPD、MM、MD、BMGY和BMMY (配方參見Invitrogen公司的畢赤酵母表達手冊)。

1.3 工具酶和生化試劑

多重定點突變試劑盒 (QuikChange?multi site-directed mutagenesis kit) 為 Stratagene公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶Sal I、DNA分子量標準和質(zhì)粒提取試劑盒為 TaKaRa公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)分子量標準為MBI公司產(chǎn)品；酵母粉和蛋白胨為英國OXOID公司產(chǎn)品；YNB購自上海晶美生物公司；可溶性木聚糖4-O-Me-D-glucurono- D-xylan (From birchwood)和Bradford 試劑為Sigma公司產(chǎn)品；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 定點突變

采用Stratagene公司的多重定點突變試劑盒，以重組質(zhì)粒pPIC9K-xyn II為模板，突變引物 (表1) 設(shè)計用Stratagene公司的在線引物設(shè)計軟件。反應體系含2.5 μL 10× QuikChange?Multi reaction buffer、0.75 μL QuikSolution、1 μL dNTP mix、1 μL 10× QuikChange?Multi enzymes blend，各引物 (T2C、T28C、S156F) 的量均為10 pmol。PCR條件：95℃預變性1 min；95℃變性1 min，55℃退火1 min，65℃延伸 20 min。PCR產(chǎn)物經(jīng) Dpn I消化，轉(zhuǎn)化XL10-Gold感受態(tài)細胞，涂布在含氨芐青霉素LB平板上。具體操作步驟參見Stratagene公司多重定點突變試劑盒的說明手冊。挑取陽性克隆子培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，送金思特 (南京) 有限公司進行測序。

表1 突變引物Table 1 Mutated primers

1.5 重組木聚糖酶工程菌的構(gòu)建與表達

1.5.1 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化與篩選

將突變質(zhì)粒pPIC9K-ha12用Sal I單酶切使之線性化，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GS115，轉(zhuǎn)化液涂布于不含組氨酸的MD平板，30℃條件下培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。挑取轉(zhuǎn)化子，點種到含 0、0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 g/L G418的YPD培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)2 d，在高濃度G418平板上生長的為高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子用于后續(xù)發(fā)酵表達。電轉(zhuǎn)化及篩選方法參見Invitrogen公司操作手冊。

1.5.2 重組畢赤酵母工程菌株的誘導表達

將陽性轉(zhuǎn)化子接種于含25 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL的搖瓶中，30℃、260 r/min搖床培養(yǎng)到OD600至2.0~6.0。離心收集菌體，用一定體積的BMMY重懸菌體，使其OD600大約在1.0，30℃、260 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h補加適量甲醇至體積分數(shù)1%。每12 h取樣，離心5 min，收集上清液，即為粗酶液。

1.6 重組木聚糖酶的純化

收集酵母發(fā)酵上清液，以分子量為10 kDa的超濾管 (Sartorius stedim biotech gmbH)，濾去小分子量蛋白和鹽，經(jīng)過分子篩Superdex 75 prep grade純化，上樣量為2 mL，使用去離子水，流速0.5 mL/min洗脫，分布收集洗脫峰中的樣品，經(jīng)過酶活測定，確定目的樣品所在的收集管，得到電泳純的目標蛋白。純化倍數(shù)計算公式：純化酶比酶活÷粗酶比酶活；酶活回收率計算公式：(純化酶比酶活×純化酶蛋白濃度×純化酶體積) ÷ (粗酶比酶活×粗酶蛋白濃度×粗酶體積) ×100%。利用Bradford法[13]測定蛋白含量；SDS-PAGE方法見參考文獻[14]。

1.7 蛋白的去糖基化處理

樣品采用Endo Hf(New England BioLabs) 進行去糖基化處理。反應條件如下：將20 μg糖蛋白于1倍糖蛋白變性緩沖液中100℃煮沸10 min使其變性；加入1/10體積10倍G5緩沖液；加入1~5 μL Endo Hf，37℃條件下溫育1 h，然后進行電泳鑒定。

1.8 木聚糖酶酶活測定

酶活定義以樺木木聚糖 (Sigma公司) 為底物每分鐘產(chǎn)生1 μmol木糖所需的酶量為一個酶活力單位 (1 IU)。采用DNS定糖法測定木聚糖酶的活性[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變位點的確定

來源于里氏木霉的木聚糖酶XYN II是屬于G/11家族木聚糖酶，這個家族的空間結(jié)構(gòu)類似于右手半握形狀：由2個β-折疊片層和1個α-螺旋組成[16]，折疊片層大部分是由反平行 β-折疊所組成的。兩個β-折疊片層的疏水面堆積在一起形成三明治形狀，稱為“手指”形狀。有報道稱在木聚糖酶的N-末端添加二硫鍵可以提高酶的熱穩(wěn)定性[10]，而且分析木聚糖酶XYN II結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)其分子結(jié)構(gòu)中不含二硫鍵。同時考慮到N-末端遠離催化活性位點，添加二硫鍵不會影響其催化活性。木聚糖酶XYN II的第2位和第28位的蘇氨酸分別位于2個平行的β-折疊片上，將其突變?yōu)榘腚装彼?，從而形成了一個分子內(nèi)的二硫鍵，加固了木聚糖酶的結(jié)構(gòu)，使其在極端的環(huán)境中，能夠較好地維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，保證了其性質(zhì)上的穩(wěn)定。文獻[7]中所報道的重組木聚糖酶 (即本實驗中的木聚糖酶) 其最大酶活為 1.45 IU/mL，這與文獻[17]中報道的9.58 IU/mL的酶活有較大的差距。將2個酶的基因序列進行比對發(fā)現(xiàn)只有156位點存在差異。因此將156位點的絲氨酸突變?yōu)楸奖彼?，提高酶的疏水性，增強酶和底物的相互作用，以期提高酶活。所用木聚糖酶結(jié)構(gòu)及各突變位點如圖 1所示。

2.2 定點突變

以pPIC9K-xyn II為模板，通過PCR擴增，Dpn I酶消化，使生成的帶3個突變的單鏈環(huán)，轉(zhuǎn)化進 E. coli，形成雙鏈重組表達質(zhì)粒。構(gòu)建出pPIC9K-ha12。通過測序分析，確定突變位點與目標設(shè)計的突變位點一致。

圖1 木聚糖酶XYN II結(jié)構(gòu)及各突變位點Fig. 1 Structure of xylanase XYN II and the mutated site.

2.3 重組木聚糖酶菌株的篩選、表達和重組木聚糖酶的純化

2.3.1 重組木聚糖酶菌株的篩選、表達

將突變質(zhì)粒pPIC9K-ha12用Sal I單酶切使之線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，在MD篩選培養(yǎng)基上篩選得到100個陽性轉(zhuǎn)化子，進一步點種于含有不同濃度梯度 G418的 YPD平板上，獲得了35個陽性轉(zhuǎn)化子。采用BMMY培養(yǎng)基分別誘導表達這些陽性轉(zhuǎn)化子，測定酶活，獲得高表達菌株P(guān). pastoris OU and P. pastoris HA12 (見表2)。

表2 重組木聚糖酶XYN IITable 2 Combination of XYN II mutations

以1%甲醇為碳源誘導表達重組畢赤酵母，誘導48 h后停止，離心得到粗酶液。粗酶液的酶活力分別為 XYN-OU：(3.202±0.08) IU/mL，XYN-HA12：(28.591±0.97) IU/mL；酶蛋白量分別為XYN-OU：(0.066±0.002) mg/mL，XYN-HA12：(0.154±0.006) mg/mL；比酶活分別為 XYN-OU：48.52 IU/mg，XYN-HA12：185.66 IU/mg。

2.3.2 重組木聚糖酶的純化

收集酵母發(fā)酵上清液 (圖2A)，以分子量為10 kDa的超濾管，濾去小分子量蛋白和鹽，然后經(jīng)過分子篩Superdex 75 prep grade純化，重組木聚糖原酶XYN-OU和重組突變酶XYN-HA12的主要純化結(jié)果見表3。其中原酶XYN-OU的純化倍數(shù)為4.2，酶活回收率為31.31%；突變酶XYN-HA12的純化倍數(shù)和酶活回收率分別為4.6和23.94%。對純化酶SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示，經(jīng)過FPLC (Fast protein liquid chromatography) 分離后，原酶XYN-OU達到電泳純；純化后的突變酶HA12在電泳圖譜中顯示2條帶，對樣品進行去糖基化處理后進行電泳鑒定(圖 2B)，發(fā)現(xiàn)圖譜中只顯示一條帶。畢赤酵母在表達外源蛋白時會出現(xiàn)不同程度的糖基化修飾，說明另外一條帶是糖基化的木聚糖酶。里氏木霉產(chǎn)木聚糖酶的分子量為20.3 kDa[14]，而重組木聚糖酶的分子量為 21 kDa。從表 3的數(shù)據(jù)可以看出，突變酶XYN-HA12的比酶活比XYN-OU的高很多。

圖2 酶液的SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE analysis of xylanase. (A) The crude xylanase. M: protein marker; 1: XYN-OU; 2: XYN-HA12. (B) The purified xylanase. M: protein marker; 3: XYN-HA12; 4: XYN-OU; 5: deglycosylation enzyme XYN-HA12; 6: deglycosylase.

表3 野生酶和突變酶的比較Table 3 Comparison of xylanase from the wild type and the mutant enzymes

2.4 突變酶與原酶酶學性質(zhì)的比較

2.4.1 最適反應溫度和熱穩(wěn)定性

溫度對木聚糖酶酶活的影響如圖3A所示，突變酶XYN-HA12在55℃~65℃時酶活較高，最適反應溫度為60℃，比原酶XYN-OU的最適反應溫度升高了10℃。突變酶在65℃時相對酶活達95.56%，比原酶的27.65%提高很多；在70℃條件下突變酶的相對酶活為 68.07%，相比原酶的14.68%，酶活也有較大程度提高。突變酶XYN-HA12所加的二硫鍵加固了XYN II N-末端的2個β折疊片，當溫度發(fā)生改變時，酶構(gòu)象的變化速率將降低，或者說酶構(gòu)象對溫度的變化不敏感，因此，突變酶的耐熱性有很大的提高。

實驗結(jié)果顯示，在70℃條件下，半衰期由原酶XYN-OU的1 min延長到突變后酶XYN-HA12的14 min (數(shù)據(jù)未顯示)。熱穩(wěn)定性實驗如圖3B所示，在60℃條件下，保溫10 min后，原酶XYN-OU的酶活全部喪失，而突變酶XYN-HA12的酶活在保溫10 min后并沒有變化；在70℃條件下，原酶保溫2 min后酶活全部喪失，而突變酶保溫2 min后其相對酶活達81.64%，并且在保溫10 min后，相對酶活還可以保持在66.82%，這充分說明突變后XYN II的熱穩(wěn)性有很大的提高。

2.4.2 最適反應pH和pH穩(wěn)定性

用100 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配置不同pH的1.0%木聚糖底物測定酶活，結(jié)果如圖4A所示。pH 5.0~6.0之間突變酶和原酶的相對酶活處在同一個水平，證明該酶在此范圍內(nèi)對pH不敏感，從圖4A中可以看出2個酶的最適pH基本相同，pH 5.0~6.0時具有較高酶活。

圖3 原酶與突變酶的最適反應溫度和熱穩(wěn)性比較Fig. 3 Comparison of the optimum temperature and thermostability between the native and mutated xylanase. (A) Comparison of the optimum temperature. (B) Comparison of the thermostability.

將純化木聚糖酶置于不同pH緩沖液 (pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0時采用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液；pH為9.0和10.0時采用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液) 中，在50℃下放置30 min后測定酶活(pH 5.0，50℃)，考察突變酶與原酶在50℃下的pH穩(wěn)定性。實驗結(jié)果如圖4B所示，原酶在pH 4.0~9.0之間相對酶活都保持在 50%以上，而突變酶在3.0~10.0之間的相對酶活都保持在50%以上，很明顯比原酶的pH穩(wěn)定性范圍擴大了。值得注意的是，pH 9.0時的相對酶活都較pH 8.0時的大，可能與所用緩沖液不同有關(guān)。

圖4 原酶與突變酶的最適pH和pH穩(wěn)定性比較Fig. 4 Comparison of the optimum pH value and pH stability between the native and the mutated xylanase. (A) Comparison of the optimum pH. (B) Comparison of the pH stability.

3 討論

本研究中的突變酶相對于原酶來說，比酶活由原來的48.52 IU/mg提高到185.66 IU/mg，酶活的提高與156位點的突變有很大關(guān)系，由絲氨酸突變?yōu)楸奖彼?，提高了酶的疏水性，增強了酶和底物的相互作用。最適反應溫度由 50℃提高到 60℃，在70℃的半衰期由1 min提高到14 min，在50℃無底物條件下的pH穩(wěn)定范圍由4.0~9.0擴展到3.0~10.0，而最適pH沒有變化，保持在pH 5.0。二硫鍵的構(gòu)建，可能使得酶蛋白的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，在極端的環(huán)境中能夠減緩酶結(jié)構(gòu)變化的速率[18]。使木聚糖酶XYN II適宜應用于生物漂白過程。

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Enhancing stability of Trichoderma reesei xylanase (XYN II) by site-directed mutagenesis

Chengye Han, Shiyuan Yu, Jia Ouyang, Xin Li, Juan Zhou, and Yan Xu

Key Laboratory of Forest Genetics & Biotechnology, Ministry of Education, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China

We engineered a disulphide bridge between two adjacent double-layered β-sheet at the N-terminal region of Trichoderma reesei endo-1,4-β-xylanase II(XYN II) by site-directed mutagenesis. The native xylanase XYN-OU and the mutated xylanase XYN-HA12 (T2C, T28C and S156F) were separately expressed in Pichia pastoris. Both xylanases were purified and characterized. The optimum temperature of XYN-HA12 was increased from 50°C to 60°C, relative to XYN-OU. At 70°C, the halftime of inactivation for XYN-OU and XYN-HA12 were 1 min and 14 min, respectively. The optimum pH of XYN-HA12 was 5.0, similar to XYN-OU. However, XYN-HA12 could retain over 50% activity from pH 3.0 to 10.0 at 50°C for 30 min. As for XYN-OU, it could retain over 50% activity from the pH value 4.0 to 9.0 at 50°C in 30 min. The result of the mutated xylanase indicated that constructed disulphide bridge could improve its thermostability at relatively higher temperature.

site directed mutagenesis, xylanase, thermostability, Trichoderma reesei

木聚糖酶 (EC3.2.1.8) 是一類以內(nèi)切方式降解木聚糖分子中β-1,4木聚糖苷鍵的酶，可廣泛應用于食品、飼料、釀造、醫(yī)藥和造紙等行業(yè)[1]。在制漿造紙的紙漿漂白工藝中添加木聚糖酶預處理，不僅能夠增加紙張白度，改善紙張性能，還能降低漂白用化學物質(zhì)用量，有效減輕造紙業(yè)對環(huán)境造成的巨大污染[2]。生物漂白是在 60℃左右、堿性條件下進行紙漿處理，要求用于生物漂白的木聚糖酶在50℃~60℃，pH 9.0~10.0堿性條件下具有較高活性。但是目前木聚糖酶漂白預處理技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應用仍然存在一些問題，由于酶在高溫和堿性環(huán)境下不夠穩(wěn)定，其工業(yè)化應用受到限制。因此，提高木聚糖酶穩(wěn)定性的研究十分必要。

November 25, 2009; Accepted: March 15, 2010

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (Nos. 2007AA02Z213, 2006AA020204), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2007CB707800).

Shiyuan Yu. Tel: +86-25-85427255; Fax: +86-25-85424121; E-mail: syu@njfu.edu.cn

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃) (Nos. 2007AA02Z213, 2006AA020204)，國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2007CB707800) 資助。