白色念珠菌毒力因子的蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

王斌，曾明，王雪松，袁靜

白色念珠菌（Candida albicans）是人體皮膚黏膜的正常寄生菌，也是臨床上重要的條件致病性真菌。它可引起皮膚、黏膜及內(nèi)臟的念珠菌病，是免疫力低下宿主感染的重要致病真菌之一，可導(dǎo)致淺表或深部的白色念珠菌病。近年來，器官移植免疫抑制劑、廣譜抗生素的使用、癌癥放療化療的增多、各種生物裝置的體內(nèi)置入和導(dǎo)管的留置、廣譜抗菌藥物的濫用和艾滋病的流行等，使得免疫功能低下者不斷增多，深部真菌感染作為一種并發(fā)病，感染率大幅上升，已成為這些疾病患者死亡的主要原因。同時由于白色念珠菌為真核生物，其生物化學(xué)代謝途徑與人類宿主有很高的相似性，很多抗真菌藥物都會有副作用或者只能抑制而不能真正殺死病原生物。因此，念珠菌病已經(jīng)從輕微的感染成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)中重要的臨床問題。由于幾種常用抗真菌藥物（如兩性霉素 B、唑類藥物和一些新的細(xì)胞壁抑制藥）的效能降低、副作用較重、抗真菌類耐藥性的出現(xiàn)，以及缺乏準(zhǔn)確和快速診斷方案[1-3]，使這種致命性條件致病菌的發(fā)病率在持續(xù)增長。因此，白色念珠菌的毒力問題一直廣受關(guān)注。

白色念珠菌既為正常菌又是條件致病菌，它能夠逃逸機(jī)體的免疫系統(tǒng)、治療藥物等，在合適的條件下進(jìn)入機(jī)體組織內(nèi)引起疾病。因而白色念珠菌的致病性和毒力可能是由一組因子決定，而不是由單一的物質(zhì)決定的。白色念珠菌的幾種毒力表現(xiàn)為對環(huán)境變化的適應(yīng)性（即表型轉(zhuǎn)換和二態(tài)性）、對宿主細(xì)胞及組織的黏附性及分泌水解酶等[4-6]。對其毒力因子的研究已成為蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究內(nèi)容，試圖揭示白色念珠菌由正常菌變?yōu)橹虏【臋C(jī)制，從而控制白色念珠菌感染、發(fā)現(xiàn)新的疫苗或能夠有更好治療作用的抗真菌藥物的靶標(biāo)。

1 白色念珠菌的白-灰轉(zhuǎn)換

1.1 轉(zhuǎn)換系統(tǒng)

白色念珠菌的白-灰轉(zhuǎn)換是自發(fā)的，而且很常見，由光滑、白色、橢圓的菌落（白色期）轉(zhuǎn)變?yōu)楸馄健⒒疑?、?xì)長或豌豆型的菌落（灰色期），除了菌落形態(tài)上的轉(zhuǎn)化，還有其他表型的轉(zhuǎn)換，如抗原的表達(dá)，對人類上皮細(xì)胞的黏附，對嗜中性粒細(xì)胞氧化劑的敏感性，活性蛋白酶的分泌，酵母-菌絲轉(zhuǎn)換中的環(huán)境約束及對藥物的敏感性等[4]。因此，這種表型轉(zhuǎn)換極有可能使白色念珠菌具有既能是正常菌又可能是致病菌的獨特的適應(yīng)性，使白色念珠菌能很快適應(yīng)環(huán)境或身體內(nèi)的特殊部位條件的改變，侵入組織內(nèi)，逃避免疫監(jiān)控和（或）發(fā)展為藥物耐受。

1.2 轉(zhuǎn)換的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

表達(dá)譜蛋白質(zhì)組學(xué)等方法已經(jīng)用于白色念珠菌白色期與灰色期細(xì)胞蛋白質(zhì)全譜的比較，以期檢測到某一期內(nèi)的有調(diào)控功能又能夠闡明其中機(jī)制的單一蛋白[7-8]。Prasad 等[7]用同位素標(biāo)記白色期和灰色期的胞質(zhì)蛋白進(jìn)行的蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)白色期有 1 個特異的蛋白點，而灰色期有2 個。他們進(jìn)一步對從白色期和灰色期分離的 mRNA 的體外翻譯表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了雙向電泳（2-DE）比較分析，同樣證明了灰色期特異的 mRNA 翻譯表達(dá)出的蛋白質(zhì)，共有3 個蛋白點的差異[8]。由于白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換時的轉(zhuǎn)換在細(xì)胞表面及抗原表達(dá)中都存在，可以推測對細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，以及對這兩期細(xì)胞的其他假想的相關(guān)蛋白的蛋白質(zhì)學(xué)研究一定會鑒定出新的轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白。

2 酵母-菌絲轉(zhuǎn)換

2.1 白色念珠菌的多形性

白色念珠菌是一種多形性的生物體，形態(tài)學(xué)上可以包括：①酵母樣出芽細(xì)胞；②假菌絲；③菌絲或菌絲體；④厚壁孢子。酵母樣出芽細(xì)胞到菌絲轉(zhuǎn)換最初的形成階段是芽管的形成。在特殊的宿主環(huán)境的刺激下，酵母與菌絲生長之間的轉(zhuǎn)換能力，決定著白色念珠菌的侵襲力。這 2 種形態(tài)在臨床損害中都存在，可能在致病過程中都發(fā)揮作用，而菌絲能夠更牢固的黏附宿主細(xì)胞，可以促進(jìn)組織滲透[9]。由于菌絲的向觸性和向藥性，菌絲能夠發(fā)現(xiàn)上皮和內(nèi)皮的破損表面并進(jìn)行滲透，侵入宿主組織。在體外模擬實驗中發(fā)現(xiàn)這種二態(tài)性可以由許多環(huán)境條件來調(diào)節(jié)，如溫度、pH及營養(yǎng)狀態(tài)（血清、N-乙酰氨基葡萄糖、脯氨酸等）[10]。

近年來，已經(jīng)建立了大量白色念珠菌酵母和菌絲蛋白的2-DE 參考圖譜[11-15]，可以進(jìn)一步直接分析酵母-菌絲轉(zhuǎn)換過程中表達(dá)物的改變?，F(xiàn)已鑒定到很多與代謝、能量產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄因子及熱休克反應(yīng)相關(guān)的蛋白。

2.2 二態(tài)性轉(zhuǎn)換的進(jìn)化

自從1980年起對白色念珠菌進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析以來，幾組研究人員[11,16]已經(jīng)利用表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)為基礎(chǔ)的手段揭示了酵母-菌絲轉(zhuǎn)換相關(guān)的蛋白，并且注意到形態(tài)發(fā)生的機(jī)制及對毒力的間接影響，通過 2-DE 對白色念珠菌酵母細(xì)胞和菌絲的全蛋白質(zhì)組學(xué)或特異的亞蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行定性和定量的比較，分別獲得蛋白表達(dá)的差異以及蛋白表達(dá)水平的數(shù)據(jù)，然后通過質(zhì)譜鑒定出二態(tài)性轉(zhuǎn)換相關(guān)的蛋白[17]。

大多數(shù)全細(xì)胞蛋白樣品的 2-DE 圖譜分析沒有發(fā)現(xiàn)白色念珠菌的菌絲體細(xì)胞存在重新合成的蛋白質(zhì)[18]。雖然在溫度調(diào)控的二態(tài)性的圖譜中，以及通過進(jìn)一步的免疫吸收和絲狀體缺失菌株試驗中，發(fā)現(xiàn)了 33 個酵母特異性胞質(zhì)蛋白點和 10 個菌絲特異性胞質(zhì)蛋白點，但只是發(fā)現(xiàn)這些“菌絲體特異”蛋白實際上是在酵母中蛋白質(zhì)的修飾體，在酵母和菌絲體免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究中也得到相似的結(jié)果。Brown和 Chaffin[19]按白色念珠菌形態(tài)發(fā)生的不同時間段進(jìn)行了詳細(xì)的亞蛋白質(zhì)組學(xué)分析，檢測到 5 個酵母特異性蛋白點及 2 個下調(diào)的菌絲蛋白點，解釋了菌絲體特異蛋白的缺乏是由于形態(tài)發(fā)生時基因表達(dá)的改變，而不是由于已存在于出芽細(xì)胞蛋白的修飾形式。

從總體看，在未經(jīng)純化的全細(xì)胞蛋白的 2-DE 圖譜上很難看出白色念珠菌不同形態(tài)發(fā)生階段的差別。有人構(gòu)建了菌絲體缺陷型，用 pH 調(diào)節(jié)二態(tài)性進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，只分辨出 1 個酵母特異性蛋白和 1 個菌絲特異性蛋白。導(dǎo)致這種不顯著變化的原因可能是翻譯后修飾、轉(zhuǎn)化率或是由于 2-DE 技術(shù)不能檢測低豐度調(diào)控蛋白的缺點造成的。同樣，依賴 pH 的葡萄糖和半乳糖誘導(dǎo)的芽管和不依賴 pH的N-乙酰氨基葡萄糖誘導(dǎo)的芽管的 2-DE 圖譜中蛋白表達(dá)的差異也比較少。由于白色念珠菌生長或 pH 特異性的蛋白的表達(dá)不受形態(tài)發(fā)生因素的影響，因而也沒有發(fā)現(xiàn)與形態(tài)有關(guān)的獨立的蛋白。這些蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)表明，大量涉及二態(tài)性的蛋白在細(xì)胞內(nèi)似乎是一種低水平表達(dá)或是短暫出現(xiàn)。因此，研究者開始剖析一些關(guān)鍵的亞蛋白質(zhì)組學(xué)，而不是全蛋白質(zhì)組學(xué)，去研究關(guān)于兩種形態(tài)建立的線索[11,16]。

Choi 等[18]在對血清和溫度調(diào)控的二態(tài)性的菌絲胞質(zhì)蛋白的蛋白膠圖中可見的 11個上調(diào)蛋白點中的 6 個蛋白點用 MALDI-TOF-MS 鑒定出了 3 種蛋白質(zhì)，其中 Pra1p（pH 調(diào)節(jié)抗原）和 Phr1p（pH 應(yīng)答蛋白）首先被圈定為涉及形態(tài)發(fā)生的分子。這 2 種蛋白在菌絲細(xì)胞中糖基化程度很高，而缺失突變株的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，Pra1p的表達(dá)依賴 Phr1p 的存在，說明 PRA1 基因可能位于PHR1 基因的下游。但是，這種調(diào)節(jié)機(jī)制對菌絲轉(zhuǎn)換的作用效果還需要進(jìn)一步的研究。目前已知幾種轉(zhuǎn)錄因子和介導(dǎo)其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白能夠調(diào)控酵母和菌絲特異性基因的表達(dá)[20]，Niimi 等[21]利用肝素的陰離子特性，帶有 DNA 結(jié)合活性的蛋白可以通過肝素-瓊脂糖親和層析被分離出來，證明了一些 DNA 結(jié)合蛋白包括 DNA 結(jié)合復(fù)合物中的蛋白，在二態(tài)性轉(zhuǎn)換期間的合成是不同的。這表明在 S100 層析柱中檢測不到的低豐度蛋白可能是細(xì)胞對白色念珠菌早期芽管形成有關(guān)的生理應(yīng)答、相關(guān)的細(xì)胞周期和形態(tài)發(fā)生中的變化起關(guān)鍵作用的調(diào)控因子。

白色念珠菌酵母-菌絲轉(zhuǎn)換包括了細(xì)胞壁的組織和成分的變化。大部分細(xì)胞壁蛋白中的蛋白可以根據(jù)它們與其他細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分的相互作用而分離出來。這種細(xì)胞壁蛋白經(jīng)過富集后蛋白質(zhì)組學(xué)分析，揭示了發(fā)生在酵母-菌絲轉(zhuǎn)換期間的細(xì)胞壁變化與細(xì)胞壁蛋白組成的數(shù)量及性質(zhì)變化都是密切相關(guān)的[11]，在出芽和絲狀體中的調(diào)控是不同的，2 種形態(tài)的細(xì)胞壁蛋白與胞壁多糖（β-葡聚糖和殼多糖）的共價結(jié)合也不同。這些顯著的現(xiàn)象闡明細(xì)胞壁蛋白-殼多糖的連接很可能是大多數(shù)細(xì)胞壁蛋白共價吸附菌絲細(xì)胞壁的保持機(jī)制。用 MS 及 MS-MS 聯(lián)用方法在酵母和菌絲細(xì)胞中鑒定出了 15 種不同調(diào)控的細(xì)胞壁蛋白，發(fā)現(xiàn)了菌絲體壁上有些糖酵解的酶有很強(qiáng)的表達(dá)，而且不論是新的結(jié)構(gòu)裝入細(xì)胞壁還是局部的細(xì)胞壁組成成分間的共價結(jié)合都在芽管形成時發(fā)生。

Urban 等[22]通過不滲透膜的生物素結(jié)合的親和純化的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，也獲得了白色念珠菌細(xì)胞壁蛋白與酵母和菌絲細(xì)胞的非共價連接的表達(dá)差異。盡管在 2 種生長形式的中發(fā)現(xiàn)了 26 個不同的細(xì)胞壁蛋白，而在 2 種形態(tài)中都發(fā)現(xiàn)了 4 種細(xì)胞壁蛋白，但只有 1 種蛋白——硫醇特異性抗氧化劑樣蛋白（Tsa1p）——證實了在二態(tài)性轉(zhuǎn)換期間的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn) Tsa1p 定位在酵母形式的細(xì)胞核和細(xì)胞液內(nèi)，在菌絲中這種蛋白定位有部分轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的表面，說明它在細(xì)胞壁的表達(dá)可能被不同的移位作用所調(diào)控。

3 黏附作用

3.1 過量的宿主識別生物分子

黏附是致病過程的關(guān)鍵步驟，也是定植的必需條件，是重要的入侵前奏。許多真菌細(xì)胞的表面成分或基團(tuán)，如特異性受體、疏水性蛋白質(zhì)或寡聚蛋白，可以介導(dǎo)白色念珠菌與上皮或內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（如層黏連蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白）、血清蛋白（如纖維蛋白原、維蛋白溶酶原、iC3b 和 C3d 補(bǔ)體片段）、植入宿主體內(nèi)的醫(yī)療器具（形成所謂的生物膜）等結(jié)合，這些識別宿主的生物分子被稱為黏附素。它們可變性提示了白色念珠菌侵襲和定植位點的多樣性[23-24]。

3.2 新型宿主識別生物分子

科學(xué)家的最初研究集中在“結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)”，應(yīng)用這種技術(shù)可以同時篩選白色念珠菌的細(xì)胞表面蛋白，這些蛋白可以與宿主配體通過蛋白-蛋白相互作用進(jìn)行識別和介導(dǎo)附著，即黏附素配體相互作用。隨著 2-DE 和應(yīng)用特異抗體的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)組技術(shù)為白色念珠菌中發(fā)現(xiàn)與黏附相關(guān)的新蛋白或基團(tuán)特性的分析作出巨大貢獻(xiàn)[25-27]。

3.2.1 纖維蛋白溶酶原結(jié)合蛋白 與其他微生物病原體一樣，白色念珠菌可能黏附宿主的纖維蛋白溶酶原并且誘導(dǎo)其激活，隨后觸發(fā)宿主衍生的蛋白酶水解系統(tǒng)，能夠潛地增加真菌對組織的侵襲和分解作用，如白色念珠菌穿過體外血-腦脊液屏障的能力會由于纖維蛋白溶酶原的活性形式——纖維蛋白溶酶的存在而增強(qiáng)[28]。

Crowe 等[25]應(yīng)用 2-DE 和隨后的配體與纖維蛋白溶酶原印跡技術(shù)、MALDI-TOF MS分析時，在白色念珠菌細(xì)胞壁蛋白抽提物中鑒定出 8 種蛋白質(zhì)（4 個糖酵解和 1 個發(fā)酵相關(guān)的酶，2 個氧化還原蛋白，1 個延伸因子），具有與纖維蛋白溶酶原結(jié)合能力，其中大部分是具有 5 個羧基末端含有賴氨酸殘基的細(xì)胞壁蛋白。同時這些結(jié)果也得到了生物化學(xué)試驗的支持，證明了纖維蛋白溶酶原與細(xì)胞壁蛋白的結(jié)合依賴于這些殘基，而不是甘露糖蛋白的糖基基團(tuán)，因為這類結(jié)合：①受賴氨酸類似物 εACA 的抑制；②用堿性羧基酶處理后結(jié)合力降低；③在蛋白糖基化缺陷的白色念珠菌突變體中保守。其他的功能分析表明，結(jié)合到白色念珠菌細(xì)胞表面的纖維蛋白溶酶原可能被宿主纖維蛋白溶酶原激活子激活為纖維蛋白溶酶。雖然纖維蛋白溶酶與白色念珠菌結(jié)合后能夠在體外降解纖維蛋白，但并沒有增加在穿透和損傷內(nèi)皮細(xì)胞、侵入內(nèi)皮基質(zhì)方面的能力，因此，還需要進(jìn)一步研究纖維蛋白溶酶原的激活在白色念珠菌體內(nèi)侵襲過程中的作用。

3.2.2 泛素化的細(xì)胞表面受體 在白色念珠菌中表達(dá)的特異表面受體中，整合素樣受體能夠應(yīng)用 RGD 序列通過蛋白-蛋白相互作用結(jié)合宿主蛋白，這類整合素樣受體包括層黏連蛋白、纖維蛋白素原、纖連蛋白、iC3b 和 C3d 補(bǔ)體片段等[29]。2-DE、多克隆抗體抑制泛素和 3個純化的整合素樣受體蛋白的抗體做的免疫印跡實驗都表明了白色念珠菌的表面受體是泛素化的。泛素化修飾在調(diào)節(jié)這些受體活性中發(fā)揮了主要作用，并且因此而影響到白色念珠菌對宿主結(jié)構(gòu)的黏附作用。

3.2.3 疏水性蛋白質(zhì) 細(xì)胞表面疏水性似乎在黏附宿主細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和導(dǎo)管以及躲避吞噬細(xì)胞的監(jiān)視方面發(fā)揮了重要作用。Singleton 等[30]應(yīng)用疏水相互作用色譜、高效液相色譜、2-DE、免疫印跡、LC-MS/MS等方法，鑒定出了 Csh1p 蛋白（38 kD 的細(xì)胞表面疏水蛋白），此蛋白是新的、功能未知的白色念珠菌基因產(chǎn)物，能夠介導(dǎo)與宿主蛋白配體的結(jié)合[31]。

4 胞外水解酶的產(chǎn)生

4.1 廣泛的底物特異性

白色念珠菌能夠產(chǎn)生與毒力相關(guān)并且具有廣泛底物特異性的胞外水解酶，如分泌型天冬氨酸蛋白酶（Sap）、磷脂酶和脂肪酶等。在芽體和絲狀體形式的菌體中都發(fā)現(xiàn)了這些酶，它們分別提高了宿主表面點狀腔的糜爛和在酵母菌絲中的滲透性生長。這些水解酶可能有助于細(xì)菌滲透和侵襲宿主屏障、黏附到宿主黏膜表面、使宿主防御分子失活，并可以通過水解作用將聚合物分解為營養(yǎng)源[32]。白色念珠菌的胞外蛋白水解活性歸因于 Sap 的存在，Sap 是由 SAP 基因家族的 10 個基因編碼的，這些 Sap（特別是 Sap酶譜中的主要同功酶 Sap2p）能夠水解多種宿主底物，包括結(jié)構(gòu)蛋白、蛋白酶抑制物、級聯(lián)系統(tǒng)中的蛋白、體液防御蛋白、細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)等[32-33]。

4.2 白色念珠菌胞外蛋白的水解活性

通過在白色念珠菌細(xì)胞培養(yǎng)基中添加黏蛋白作為氮源或碳源，富集培養(yǎng)濾液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，可以鑒別作為主要黏蛋白降解酶的 Sap2p，也可以檢測少量的可能是黏蛋白分解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)。黏蛋白分解時可以觀察到它的 N 末端氨基酸序列與成熟的 Sap 無同源性，而且其酶譜和代謝標(biāo)記均為陰性。白色念珠菌 Sap2p 的胞外黏蛋白分解活性可以用酶譜方法進(jìn)行測定。此外，以前報道過小鼠空腸灌胃接種白色念珠菌，這種體外研究更加提示了 Sap2p 能夠作為酶負(fù)責(zé)體內(nèi)黏蛋白層的進(jìn)行性的胞外消化。

5 結(jié)語

白色念珠菌的毒力因子和致病機(jī)制非常復(fù)雜，但是目前已完成白色念珠菌的基因組測序和注釋。近年來，已經(jīng)完善了對白色念珠菌生物學(xué)和病原特性的解釋，一些重要的結(jié)果是通過運(yùn)用高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)方法獲得的，揭示了白色念珠菌是如何在分子水平上發(fā)揮作用的，而這些作用僅靠基因組學(xué)的研究是無法預(yù)料的。因此，從分子水平研究有機(jī)體的功能生物學(xué)也隨著技術(shù)的提高得到了快速發(fā)展。隨著對白色念珠菌的黏附素、磷脂酶等毒力因子以及其與細(xì)菌、巨噬細(xì)胞等相互作用研究的深入，白色念珠菌在黏附有機(jī)物表面或活組織后是如何將信號傳導(dǎo)到細(xì)胞核導(dǎo)致基因進(jìn)行協(xié)調(diào)表達(dá)的等過程將會逐步被揭開。對這種相互作用網(wǎng)絡(luò)的了解，必將對白色念珠菌感染的預(yù)防和治療提供有益的線索。

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