[125I]TZDM的制備

王武尚，張錦明，劉伯里

1.西北核技術(shù)研究所，陜西 西安 710024；2.北京師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，北京 100875；3.解放軍總醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100853

隨著社會(huì)老齡化的發(fā)展，阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD，又稱老年性癡呆癥)嚴(yán)重影響著老年人的身心健康和生活質(zhì)量，因此，關(guān)于AD的研究日益受到各國政府和國內(nèi)外學(xué)者的高度重視。Aβ斑塊(β-Amyloid plaques)是AD病的一種生物標(biāo)志物，對(duì)AD的早期診斷和病情監(jiān)測而言，親Aβ斑塊的試劑具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。以AD病理特征的Aβ斑塊為生物化學(xué)標(biāo)志，制備親Aβ斑塊的放射性分子探針，利用PET和SPECT技術(shù)可進(jìn)行顯像測定Aβ斑塊的位置和數(shù)量，對(duì)開發(fā)新的AD治療方法和進(jìn)一步了解AD的發(fā)病機(jī)制具有重要作用。

苯并噻唑類Aβ顯像劑具有非常大的發(fā)展?jié)摿1]，是根據(jù)硫磺素-T發(fā)展而來，具有較高的脂溶性，有利于穿透BBB，而且與Aβ斑塊也有很高的親和性。11C-6-OH-BTA-1([N-Me-11C]2-[4-(methylamino)-phenyl]-6-hydroxybenzothiazole，簡稱PIB或11C-PIB)[2-5]，是人類歷史上首次成功地顯像檢測AD病人腦內(nèi)淀粉樣斑塊的顯像劑。2-(對(duì)二甲氨基苯基)-6-碘苯并噻唑(2-(4’-dimethylaminophenyl)-6-iodobenzothiazole,[125I]TZDM)是目前對(duì)Aβ斑塊親和性最高的一個(gè)化合物[6-7]，體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，[125I]TZDM與Aβ1-40纖維結(jié)合物的解離常數(shù)(Kd)為6×10-11mol/L。目前，在研究Aβ斑塊顯像劑的親和性時(shí)，AD腦組織切片非常缺乏，AD轉(zhuǎn)基因老鼠模型很昂貴。在此情況下，體外配體競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)是篩選Aβ斑塊顯像劑的有效方法，采用人工合成的Aβ1-40纖維為受體，[125I]TZDM為放射性競爭配體，測量目標(biāo)化合物的抑制常數(shù)[7-10]。本工作以對(duì)溴苯胺為起始原料，經(jīng)過四步反應(yīng)合成[125I]TZDM的前體化合物Bu3Sn-TZDM，通過125I標(biāo)記反應(yīng)和HPLC分離，制備高放射化學(xué)純度的[125I]TZDM。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

對(duì)溴苯胺，純度大于99%，美國Acros Organics公司；柱層析硅膠，青島海洋化工集團(tuán)公司；4-二甲氨基苯甲醛，純度大于99%，美國Alfa Aesar公司；三丁基錫，純度95%，德國Aldrich公司；四(三苯磷)鈀，純度99.8%，美國Alfa Aesar公司；[125I]NaI，無載體，北京原子高科股份有限公司；3,3-二甲基戊二酸，英國AVOCADO公司；Necolet-170SX傅立葉紅外儀，美國Necolet公司；Avance 500 MHz核磁共振儀，美國Bruker公司；TrisGC2000質(zhì)譜儀，美國Finnigan公司；Perkin-Elmer 240-C型元素分析儀，美國PE公司；分析型HPLC、2487型紫外分光分度計(jì)、515泵，美國Waters公司；Flow-Count放射性檢測器，美國Bioscan公司；HypersilC4分離柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，英國ThermoHypersil公司；XT4顯微熔點(diǎn)測定儀，北京泰克儀器有限公司，溫度未校正。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 前體化合物6-Bu3Sn-TZDM的合成

以對(duì)溴苯胺為起始原料，根據(jù)文獻(xiàn)[11-12]合成了中間體5-溴-鄰氨基苯硫酚。然后依照文獻(xiàn)[7]合成2-(4’-二甲氨基苯基)-6-三丁基錫基苯并噻唑(6-Bu3Sn-TZDM)。合成路線如下：

1.2.12-氨基-6-溴苯并噻唑合成 反應(yīng)瓶中加入5.2 g(30 mmol)對(duì)溴苯胺、6.8 g(90 mmol)硫氰酸銨和60 mL冰乙酸，室溫?cái)嚢柘戮徛渭雍?.8 g(30 mmol)溴水的20 mL冰乙酸溶液，室溫繼續(xù)攪拌30 min。然后加熱回流3 h，再室溫?cái)嚢璺磻?yīng)10 h。向反應(yīng)液中加入100 mL水，加熱至沸，趁熱抽濾，熱水洗滌沉淀(30 mL×2)。濾液用氨水調(diào)節(jié)pH=8～9，置于冰箱冷卻。抽濾，水洗沉淀(50 mL×2)，用甲醇-苯重結(jié)晶，干燥后得淡黃色沉淀6.3 g。產(chǎn)率91.0%，熔點(diǎn)206～210 ℃。

1.2.22-氨基-5-溴苯硫醇合成 反應(yīng)瓶中加入6.3 g(27.5 mmol)2-氨基-6-溴苯并噻唑，31.5 g KOH，80 mL水，加熱回流8 h。反應(yīng)液冷卻至室溫，加入40 mL水，過濾除去不溶物。攪拌下向?yàn)V液中加入36%乙酸至微酸性，置于冰箱冷卻。抽濾，水洗沉淀(50 mL×3)。沉淀用乙酸乙酯-正己烷重結(jié)晶，得黃色沉淀3.0 g。產(chǎn)率為53.4%，熔點(diǎn)111～114 ℃。

1.2.32-(4’-二甲氨基苯基)-6-溴苯并噻唑的合成 反應(yīng)瓶中加入1.1 g(5.4 mmol)2-氨基-5-溴苯硫醇、0.8 g(5.4 mmol)4-二甲氨基苯甲醛、10 mL二甲基亞砜，加熱回流30 min。反應(yīng)液冷卻至室溫，有大量黃色沉淀生成，加入30 mL水，攪拌。抽濾，水洗沉淀(10 mL×3)。沉淀經(jīng)硅膠柱層析分離，得淡黃色固體產(chǎn)物1.2 g，產(chǎn)率66.9%。熔點(diǎn)214～216 ℃。

1.2.42-(4’-二甲氨基苯基)-6-三丁基錫基苯并噻唑合成 反應(yīng)瓶中加入0.6 g(1.8 mmol)2-(4’-二甲氨基苯基)-6-溴苯并噻唑、20 mL二氧六環(huán)、20 mL甲苯、20 mL三乙胺、2.0 mL三丁基錫和200 mg四-(三苯磷)鈀，加熱回流12 h。旋轉(zhuǎn)除去溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析分離，得黃色固體產(chǎn)物0.48 g，產(chǎn)率49.0%。熔點(diǎn)56～62 ℃。

1.3 [125I]TZDM的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[13]方法，采用無載體Na125I在酸性條件下標(biāo)記制備[125I]TZDM，標(biāo)記路線如下：

稱取1 mg 6-Bu3Sn-TZDM前體，溶于1 mL乙醇中，取50 μL，加入10 μL 5%的H2O2，再加入50 μL 1 mol/L HCl,最后加入50 μL 0.1 mol/L NaOH溶解的Na125I，室溫反應(yīng)10 min，用Na2S2O4中止反應(yīng)。用乙酸乙酯萃取2次，每次1 mL，蒸發(fā)有機(jī)相，殘留物用乙腈溶解，HPLC分離(C4，250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為5 mmol/L pH=7.03的3-二甲基戊二酸溶液和乙腈混合物，體積比為2∶8，流速為1 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 6-Bu3Sn-TZDM的合成

在合成2-氨基-6-溴苯并噻唑時(shí)，對(duì)文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行了改進(jìn)，在滴加溴水的冰乙酸溶液時(shí)，取消了冰浴冷卻，控制滴加速度，反應(yīng)溫度可控制在室溫；另外，為了使反應(yīng)更加完全，增加了加熱回流步驟，這樣產(chǎn)率可達(dá)91.0%(文獻(xiàn)產(chǎn)率為92%)，產(chǎn)物熔點(diǎn)206～210 ℃。

在合成2-氨基-5-溴苯硫醇時(shí)，文獻(xiàn)[11]采用無水乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物在無水乙醇中氧化較快，故改用乙酸乙酯-正己烷溶液重結(jié)晶，可得黃色晶體產(chǎn)物，產(chǎn)率為53.4%，熔點(diǎn)為111～114 ℃(文獻(xiàn)產(chǎn)率為45%，熔點(diǎn)113～115 ℃)。

在根據(jù)文獻(xiàn)[7]合成2-(4’-二甲氨基苯基)-6-溴苯并噻唑時(shí)，采用乙酸乙酯重結(jié)晶1次不能得到純度較高的產(chǎn)物，采用硅膠柱層析分離，可得純的淡黃色固體產(chǎn)物，產(chǎn)率66.9%(文獻(xiàn)產(chǎn)率68%)。在合成2-(4’-二甲氨基苯基)-6-三丁基錫基苯并噻唑時(shí)，文獻(xiàn)[7]由于合成量只有幾十mg，采用制備型薄層色譜分離純化產(chǎn)物，本工作采用硅膠柱層析分離產(chǎn)物，合成量較大，產(chǎn)率高達(dá)49%(文獻(xiàn)產(chǎn)率33.6%)。

2.2 6-Bu3Sn-TZDM結(jié)構(gòu)表征

在前體化合物6-Bu3Sn-TZDM的合成過程中，中間體僅通過紅外光譜進(jìn)行了表征，產(chǎn)物6-Bu3Sn-TZDM通過紅外光譜、1H核磁譜、質(zhì)譜和元素分析進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。

IR(KBr)：6-Bu3Sn-TZDM是叔胺，在3 500～3 300 cm-1處無N-H鍵的特征吸收峰，在1 367.5 cm-1處只有υC-N的特征吸收峰；1 606.7 cm-1和1 483.3 cm-1是苯環(huán)骨架振動(dòng)吸收峰；對(duì)二取代苯環(huán)和1,2,4-三取代苯環(huán)上δC-H的特征吸收峰在815.9 cm-1處重疊；2 956.9 cm-1是甲基υC-H的特征吸收峰；2 924.1 cm-1和2 850.8 cm-1是亞甲基υC-H的特征吸收峰。

1H NMR(500 MHz，acetone-d6，δ)：7.942 48～8.000 92(m，4H)，7.519 10～7.534 86(d，J=7.9 Hz，1H)，6.766 73～6.784 47(d，J=8.9 Hz，2H)，3.086 99(s，6H)，1.558 00～1.589 52(penta，6H)，1.350 88～1.408 17(hexa，6H)，1.112 53～1.145 19(t，6H)，0.906 07～0.935 19(t，9H)。

MS(EI)：由于錫有2個(gè)豐度較大的同位素118Sn(24.22%)，120Sn(32.59%)，以C27H40N2SSn計(jì)，分子離子應(yīng)有m/z=542.29、544.29，在質(zhì)譜圖中可以找到542.27(M+)，544.26(M+)，545.29(M++1)，546.27(M++2)。

元素分析(以C27H40N2SSn計(jì)，w，%)：計(jì)算值C，59.68；H，7.42；N，5.16；實(shí)驗(yàn)值C，56.56；H，7.32；N，4.46。

2.3 [125I]TZDM的標(biāo)記與純化

在制備配體競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)用的放射性配體時(shí)，標(biāo)記反應(yīng)必須采用無載體的125I進(jìn)行標(biāo)記，以便獲得高放射化學(xué)純度的[125I]TZDM。本工作采用三丁基錫預(yù)先定位，然后進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記反應(yīng)可在室溫下快速完成，標(biāo)記率高。本實(shí)驗(yàn)的[125I]TZDM標(biāo)記率為62.5%。[125I]TZDM的制備型HPLC放射性圖譜示于圖1。從圖1可知，雖然經(jīng)乙酸乙酯萃取，粗產(chǎn)品中仍有少量的碘離子(tR=6 min)和碘分子(tR=12.5 min)。經(jīng)HPLC純化后，由于許多產(chǎn)物被吸附在分離柱上，實(shí)際產(chǎn)率為25%，純化后的標(biāo)記物在分析型HPLC譜圖上僅有1個(gè)主峰，根據(jù)峰面積計(jì)算其放射化學(xué)純度大于97%(圖2)。

圖1 [125I]TZDM制備型HPLC放射性圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of the crude [125I]TZDM

圖2 純化后125I-TZDM分析型HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of the purified [125I]TZDM

3 結(jié) 論

本工作采用三丁基錫預(yù)先定位、再進(jìn)行125I標(biāo)記的方法，制備了[125I]TZDM，標(biāo)記率為62.5%。粗產(chǎn)物通過HPLC分離后，獲得放射化學(xué)純度大于97%的[125I]TZDM，實(shí)際產(chǎn)率為25%。[125I]TZDM的制備為今后研究Aβ斑塊顯像劑的親和性打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1] 王武尚,張錦明,劉伯里.AD腦Aβ放射性顯像劑研究進(jìn)展[J].同位素,2004,17(17):232-239.

[2] Engler H, Blomqvist G, Bergstr?m M, et al. First Human Study With a Benzothiazole Amyloid-Ima-ging Agent in Alzheimer’s Disease and Control Subjects[J]. Neurobiol Aging, 2002, 23(1): S429.

[3] Patoine B. Advances in Alzheimer’s Diagnostic Tools Expected to Speed Drug Trials[J]. Brain Work, 2002, 12(5): 1-2.

[4] Schmitt F A, Davis D G, Wekstein D R, et al. “Preclinical” AD Revisited: Neuropathology of Cognitively Normal Older Adults[J]. Neurology, 2000, 55: 370-376.

[5] Klunk W E, Engler H, Nordberg A, et al. Imaging Brain Amyloid in Alzheimer’s Disease With Pittsburgh Compound-B[J]. Ann Neurol, 2004, 55: 306-319.

[6] Kung M P, Zhuang Z P, Hou C, et al. Characterization of Radioiodinated Ligand Binding to Amyloid Beta Plaques[J]. J Mol Neurosci, 2003, 20: 249-254.

[7] Zhuang Z P, Kung M P, Hou C, et al. Radioiodinated Styrylbenzenes and Thioflavins as Probes for Amyloid Aggregates[J]. J Med Chem, 2001, 44(12): 1 905-1 914.

[8] Ono M, Wilsonc A, Nobregac J, et al.11C-Labeled Stilbene Derivatives as Aβ-Aggregate-Specific PET Imaging Agents for Alzheimer’s Disease[J]. Nucl Med Biol, 2003, 30: 565-571.

[9] Zhuang Z P, Kung M P, Hou C, et al. IBOX(2-(4’-Dimethylaminophenyl)-6-Iodobenzoxazole): A Ligand for Imaging Amyloid Plaques in the Brain[J]. Nucl Med Biol, 2001, 28: 887-894.

[10] Ono M, Kung M P, Hou C, et al. Benzofuran Derivatives as Aβ-Aggregate-Specific Imaging Agents for Alzheimer’s Disease[J]. Nucl Med Biol, 2002, 29: 633-642.

[11] Mital R L, Jain S K. Synthesis of Some 5-Substituted 2-Aminobenzenethiols and Their Conversion Into Phenothiazines via Smiles Rearrangement[J]. J Chem Soc, C, 1969: 2 148-2 150.

[12] Lin A J, Kasina S. Synthesis of 3-Substituted 7-(3,3-Dimethyl-1-Triazeno)-10-Methyl-Phenothia-zines as Potential Antitumor Agents[J]. J Heterocyclic Chem, 1981, 18: 759-761.

[13] Cai L, Chin F T, Pike V W, et al. Synthesis and Evaluation of Two18F-Labeled 6-Iodo-2-(4’-N, N-Dimethylamino)Phenylimidazopyridine Derivatives as Prospective Radioligands for β-Amyloid in Alzheimer’s Disease[J]. J Med Chem, 2004, 47: 2 208-2 218.