卵磷脂對胎兒生長受限模型子鼠學(xué)習(xí)記憶力的影響

李巍巍，任麗娜

(中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110001)

胎兒生長受限(fetal growth restriction,FGR)發(fā)病率占妊娠的2．75%～15．53%不等，中國的發(fā)病率平均為6．39%[1],是圍生期的重要并發(fā)癥之一。Alberry等[2]經(jīng)過6年的隨訪追蹤發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GR患兒的生長參數(shù)、神經(jīng)發(fā)育評分及智商等均顯著低于對照組。因此預(yù)防和減少FGR的發(fā)生有重要意義，目前孕期營養(yǎng)不良與FGR的關(guān)系已越來越受到關(guān)注，除熱能和蛋白質(zhì)不足外，維生素營養(yǎng)不足，如維生素A、維生素E、維生素B、葉酸等不足對胎兒宮內(nèi)生長的不良影響正逐漸引起人們的注意[3]。母體的健康與治療對FGR影響非常大，及時處理可改善FGR的預(yù)后[4]。卵磷脂具有增強(qiáng)組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)人體生理機(jī)能，改善脂肪代謝等功效[5]。本研究通過慢性宮內(nèi)乏氧模型探討卵磷脂攝入促進(jìn)FGR子鼠神經(jīng)發(fā)育的可行性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 大鼠FGR模型制備：無交配史大白鼠20只(由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部提供)受孕后隨機(jī)分為兩組：(1)對照組10只于妊娠第17天行腹部開關(guān)術(shù)；(2)FGR組10只于妊娠第17天行經(jīng)腹子宮動脈縮窄術(shù)。其余處理兩組相同，妊娠21～23 d分娩為足期分娩，其子鼠為本研究對象。

1.1.2 FGR子鼠判斷標(biāo)準(zhǔn):用電子天平為子鼠稱重，精確到0.01 g,以低于對照組子鼠平均體重2個標(biāo)準(zhǔn)差為FGR判斷標(biāo)準(zhǔn)，并且廢除FGR組中不符合FGR診斷標(biāo)準(zhǔn)的子鼠，本實(shí)驗(yàn)中子鼠均為FGR子鼠。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)分組：將篩選出的FGR子鼠隨機(jī)分為兩組,實(shí)驗(yàn)組與對照組各10只。兩組均以標(biāo)準(zhǔn)小鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組子鼠額外灌食卵磷脂100 mg/d[6]。

1.2 學(xué)習(xí)記憶能力檢測

1.2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：Morris水迷宮為一不銹鋼的圓形水池，內(nèi)壁黑色，直徑100 cm，高50 cm，水溫控制在(22±1)℃。水池等分為4個象限，任選其中1個象限，正中放置1個安全平臺。平臺為圓形，直徑10 cm，沒于水下1 cm。水池放在一間小屋的中央，室內(nèi)的門、窗、攝像頭等構(gòu)成視覺暗示。迷宮上方安有攝像機(jī)，并和計算機(jī)連接，自動錄入小鼠游泳軌跡并進(jìn)行分析。歷時5 d，上下午各1 次/d，入池位置為平臺所鄰2個象限的池壁中點(diǎn)。將小鼠面向池壁分別從入水點(diǎn)放入水中，記錄其在100 s內(nèi)尋找到平臺的時間(逃避潛伏期)。如果小鼠100 s未找到平臺，則由實(shí)驗(yàn)者用手牽引其至平臺上，停留10 s，逃避潛伏期記成100 s。以2次/d潛伏期算術(shù)均值作為這一天的成績進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.2 探索試驗(yàn)：撤除平臺，任選1個入水點(diǎn)將小鼠放入水中，使小鼠在無平臺情況下尋找記憶中平臺，記錄其100 s游泳軌跡，計算其在原平臺象限游泳時間和穿越原平臺次數(shù)。

1.3 神經(jīng)元原位凋亡檢測

水迷宮、探索試驗(yàn)后將實(shí)驗(yàn)組子鼠及對照組子鼠斷頭取腦，稱重，4%多聚甲醛固定24 h。從海馬平面作厚約2 mm冠狀切片，常規(guī)石蠟包埋切片。采用末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記法(Tdt-mediated dUTP nick end labeling TUNEL)。試劑盒購自瑞士Rocher 公司，參照說明書操作。結(jié)果判斷：陽性細(xì)胞為棕黃色。每個部位計數(shù)左右各3個高倍鏡(×400)視野下陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)從第1天起，實(shí)驗(yàn)組的逃避潛伏期即明顯短于對照組(P<0．01)，見表1。

表1 各組小鼠隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的比較Tab 1 Time to find platform in 2 groups (n=10)

2.2 各組小鼠探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

撤除平臺后，觀察小鼠的空間探索能力，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組軌跡大部分位于原平臺象限，其次較多地在原平臺象限相鄰的左右兩側(cè)象限尋找。對照組基本圍繞池壁游泳，其運(yùn)動軌跡呈隨機(jī)分布于各象限之中。由表2可以看出實(shí)驗(yàn)組的停留原平臺象限時間和穿越原平臺次數(shù)均明顯多于對照組(P<0.01)，見表2。

表2 各組小鼠探索實(shí)驗(yàn)的結(jié)果比較Tab 2 Result of Passive avoidance test in 2 groups (n=10)

1)與對照組比較，P<0.01

2.3 子鼠神經(jīng)元原位凋亡檢測

實(shí)驗(yàn)組子鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率平均為(2.2±0.58)個/HP,對照組為(5.08±1.21)個/HP，兩組差異有顯著性意義(P<0.01)；海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率：實(shí)驗(yàn)組平均為(0.59±0.23)個/HP，對照組為(1.71±0.63)個/HP，兩組差異有顯著性意義(P<0.01)。見表3。

表3 兩組子鼠皮層及海馬CAI區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較Tab 3 Neuronal apoptosis in cortex and hippocampus in 2 groups (個/HP)

1)與對照組比較，P<0.01

3 討 論

3.1 FGR與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育

FGR是指任何原因胎兒在宮內(nèi)生長速度受限，體重低于該孕周標(biāo)準(zhǔn)值第10百分位數(shù)以下。發(fā)生率約2.75%～15.53%[7]。迄今為止胎兒生長受限的病因尚未完全闡明，目前認(rèn)為它是多種因素作用的結(jié)果，其病因?qū)W包括環(huán)境因素和遺傳因素。最直接的原因是胎盤發(fā)育異常和循環(huán)功能障礙。研究表明，F(xiàn)GR患者的胎盤血管床阻力增加，導(dǎo)致胎盤胎兒血流灌注量減少，限制營養(yǎng)物質(zhì)攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，胎兒生長受限，甚至導(dǎo)致新生兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲滯。據(jù)報道，F(xiàn)GR新生兒神經(jīng)功能異常發(fā)生率為32%[8]。因此推測FGR胎兒神經(jīng)系統(tǒng)損傷可能與胎盤功能不全導(dǎo)致的慢性宮內(nèi)缺血缺氧有關(guān)。本研究通過結(jié)扎子宮動脈制造缺血性FGR模型，通過水迷宮實(shí)驗(yàn)等探討子鼠學(xué)習(xí)記憶力，以及通過攝取富含磷脂酰膽堿的卵磷脂，探討改善FGR子鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷的可能性。

學(xué)習(xí)記憶是大腦的高級神經(jīng)生理活動。水迷宮是英國心理學(xué)家Morrisr于20世紀(jì)80年代初設(shè)計的[9]。大鼠在多次的訓(xùn)練中，學(xué)會尋找固定位置的隱蔽平臺，形成穩(wěn)定的空間位置認(rèn)知，這種空間認(rèn)知是加工空間信息(外部線索)形成的，近年來已發(fā)展成為廣泛應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)的空間學(xué)習(xí)記憶檢測方法[10]。定位航行試驗(yàn)潛伏期的長短反映動物空間記憶的獲得情況，即學(xué)習(xí)能力。空間探索試驗(yàn)主要反映動物的記憶能力和空間定位能力。而檢測藥物干預(yù)后動物的學(xué)習(xí)記憶能力是判斷藥物療效的重要指標(biāo)之一。本研究顯示，通過攝入卵磷脂，實(shí)驗(yàn)組子鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率平均為(2.2±0.58)個/HP,對照組為(5.08±1.21)個/HP；海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率：實(shí)驗(yàn)組平均為(0.59±0.23)個/HP,對照組為(1.71±0.63)個/HP，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，皮層及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡差異有顯著性意義(P<0.01)，實(shí)驗(yàn)組子鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力較對照組明顯上升(P<0.01)。海馬區(qū)與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)，F(xiàn)GR子鼠皮層、海馬神經(jīng)元凋亡率明顯高于正常FGR子鼠，本研究顯示攝入卵磷脂有助于改善子鼠皮層、海馬神經(jīng)元凋亡從而改善FGR子鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷，有助于提高日后學(xué)習(xí)記憶能力。

3.2 FGR的長遠(yuǎn)影響

據(jù)報道，F(xiàn)GR新生兒智力和精神運(yùn)動障礙發(fā)生率較正常兒明顯增加[7]。Geva等[11]對123例FGR和正常兒童進(jìn)行了為期9年的隨訪，發(fā)現(xiàn)FGR組兒童智商、學(xué)習(xí)成績、學(xué)習(xí)記憶、語言、創(chuàng)造性等能力均比正常組兒童明顯降低。FGR患者生長及智力發(fā)育緩慢、滯后。成年后是發(fā)生內(nèi)分泌代謝障礙、心血管疾病、阻塞性肺疾病、腎臟疾病和內(nèi)分泌代謝障礙等疾病的高危人群。因此，及早發(fā)現(xiàn)、及早干預(yù)FGR對兒童生長發(fā)育有深遠(yuǎn)的意義。如何改善FGR胎兒神經(jīng)系統(tǒng)損傷，提高日后學(xué)習(xí)記憶能力，日益為眾多學(xué)者所關(guān)注。卵磷脂修復(fù)受損腦細(xì)胞，改善腦部血液循環(huán)同時維持腦神經(jīng)細(xì)胞功能，加快神經(jīng)傳導(dǎo)。卵磷脂為大豆油生產(chǎn)的副產(chǎn)品，來源廣泛，其獨(dú)特的生理功能為人們所認(rèn)識，作為食品可為人們所攝取。本研究通過補(bǔ)充卵磷脂改善FGR子鼠缺血性腦損傷，正是基于卵磷脂所含有的磷脂酰膽堿作為神經(jīng)遞質(zhì)對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有重要作用，為探尋通過早期營養(yǎng)干預(yù)改善FGR新生兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育提供思路。

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