血必凈對急性百草枯中毒鼠肺NF-κ B活性及肺損傷保護(hù)的影響

劉明偉,林 昕,張明謙,曲 艷,卜向東

(云南省昆明市延安醫(yī)院急診科 650051)

血必凈對急性百草枯中毒鼠肺NF-κ B活性及肺損傷保護(hù)的影響

劉明偉,林 昕,張明謙,曲 艷,卜向東

(云南省昆明市延安醫(yī)院急診科 650051)

目的探討血必凈注射液對大鼠百草枯(PQ)中毒急性肺損傷(ALI)的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法SD大鼠60只,隨機(jī)分為對照組、百草枯組和血必凈組,每組30只。百草枯組和血必凈組大鼠腹腔內(nèi)注射百草枯,對照組注射等體積無菌生理鹽水,血必凈組同時(shí)給予血必凈治療。3d后測支氣管肺組織NF-κ B活性細(xì)胞、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎癥細(xì)胞、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)活性和肺葉濕/干重比。結(jié)果百草枯組和血必凈組支氣管肺組織NF-κ B活性細(xì)胞、支氣管肺泡灌洗液中總細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)、BALF-NE和肺葉濕/干重比均較對照組增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),血必凈組各指標(biāo)明顯低于百草枯組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論血必凈可抑制NF-κ B及炎性細(xì)胞活性,對百草枯中毒大鼠急性肺損傷有治療作用。

血必凈;肺損傷;百草枯;NF-κ B

百草枯(paraquat,PQ,又名對草快)是一種非選擇性、接觸性除草劑,口服中毒后除引起消化道糜爛、出血外,還能損害多個(gè)重要臟器,以肺中濃度較高,可導(dǎo)致呼吸困難、急性肺水腫、進(jìn)行性肺纖維化等臨床表現(xiàn),因無特效解毒藥,目前采用的常規(guī)對癥處理效果極差,百草枯中毒患者總病死率為20%～75%[1],口服病死率更高達(dá)60%～87.8%,且存活人群中絕大多數(shù)患者存在肺間質(zhì)纖維化,預(yù)后惡劣[2]。全身炎癥反應(yīng)綜合征是百草枯中毒的常見并發(fā)癥,是通向多臟器功能衰竭綜合征(MODS)的轉(zhuǎn)折點(diǎn),而核因子-κ B(NF-κ B)是核內(nèi)炎性遞質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄的開關(guān)[3],阻斷NF-κ B的激活可能是治療成敗的關(guān)鍵。而應(yīng)用血必凈抑制NF-κ B的活化,可能有助于減輕百草枯中毒鼠的肺損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠 60只,雌雄不限,體重(300±50)g,購自昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 主要藥品和試劑 血必凈(天津紅日藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn));20%百草枯農(nóng)藥(先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司生產(chǎn))。核因子-κ B試劑盒(福州邁新公司生產(chǎn)),即用型超敏 S-P免疫組化試劑盒(福州邁新公司生產(chǎn))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將上述大鼠隨機(jī)編號分成3個(gè)組(對照組、百草枯中毒組、血必凈組),每組20只。

1.3.2 模型制作、干預(yù)措施及處理方法 選擇健康SD大鼠60只,雌雄兼有,隨機(jī)分為對照組、百草枯組和血必凈組,每組20只,在12h光照和黑暗循環(huán)條件下飼養(yǎng),自由飲水和進(jìn)食。百草枯組用20%百草枯溶液按35mg/kg腹腔內(nèi)注射;血必凈組在注射百草枯12h腹腔注射2.5g/kg血必凈注射液,每日1次,共3次;對照組注射等體積生理鹽水。造模3d后取灌洗液后處死大鼠,經(jīng)腹胸腔取肺組織標(biāo)本。

1.3.3 標(biāo)本的采集與制備 造模3d取肺泡灌洗液(BALF)后處死大鼠,經(jīng)胸腔取右肺中葉,置于10%中性福爾馬林溶液浸泡固定。固定48h后,酒精依次脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,4μ m連續(xù)切片,分別用蘇木素-伊紅(HE)和免疫組化染色。

1.3.4 BALF炎癥細(xì)胞和NE活性檢測 25%烏拉坦麻醉動(dòng)物后切開氣管,插入5mm塑料管,用5mL生理鹽水反復(fù)灌洗5次,紗布過濾,記錄回收量,計(jì)數(shù)肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞。取上清液,-20℃凍存,測定 NE活性。

1.3.5 免疫組化結(jié)果判定 S-P法測 NF-κ B的活性,應(yīng)用抗p65單克隆抗體,該抗體與 NF-κ B亞單位p65區(qū)域結(jié)合,正常情況下此結(jié)合區(qū)域被NF-κ B抑制蛋白Iκ B所覆蓋,抗p65單克隆抗體不能與之結(jié)合,只有當(dāng) Iκ B釋放后,才能結(jié)合,故該抗體能夠原位檢測到NF-κ B的活化。

1.3.6 肺組織干/濕重比 測定取右肺上葉,剔除多余結(jié)締組織,拭干表面血液,用天平精確稱量其重量即為濕重,放入80℃烤箱烘烤48h后,再次稱量其重量即為干重,確定肺濕/干重比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)NF-κ B陽性細(xì)胞率和干濕重比例進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),數(shù)據(jù)采用±s表示,單因素方差分析和兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)比較各組差異,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織NF-κ B/P65陽性細(xì)胞率 百草枯中毒組肺組織陽性細(xì)胞與對照組相比明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);血必凈組與百草枯中毒組相比陽性細(xì)胞明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肺組織NF-κ B陽性細(xì)胞率比較(n)

2.2 肺組織病理檢查 百草枯中毒組:肺充血明顯,左、右肺均變鈍圓,體積變大,局部有明顯的出血點(diǎn)或淤血。出現(xiàn)局灶性肺實(shí)變,肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤,伴彌漫性肺出血;部分肺間隔明顯斷裂出現(xiàn)典型的肺大泡表現(xiàn)。血必凈組:肺體積稍增大,淡粉紅色,切面無明顯血性滲液滲出。光鏡下:輕度肺水腫,病變以肺間質(zhì)水腫充血為主,肺間質(zhì)充血、水腫和中性粒細(xì)胞浸潤較百草枯中毒組明顯減輕,見圖1。

2.3 肺組織NF-κ B/P65陽性細(xì)胞的圖像分析及右肺上葉干/濕重比 采用美國Media Cy bemetics公司生產(chǎn)的Image Pro Plus圖像分析軟件分析可見:百草枯中毒組肺組織陽性單位最大,與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),血必凈組與百草枯中毒組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與對照組相比,百草枯組濕/干重比明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),而血必凈治療組雖較對照組升高,但仍明顯低于百草枯組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見表2。

表2 肺組織NF-κ B/p65陽性細(xì)胞陽性單位(Pu)及濕/干重比比較

2.4 灌洗液中炎癥細(xì)胞含量 百草枯組和血必凈組支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞含量(炎癥細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞)明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),而百草枯組則明顯高于血必凈組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)活性在對照組活性極低,血必凈組和百草枯組活性顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但血必凈組活性明顯低于百草枯組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見表 3。

表3 灌洗液中炎癥細(xì)胞含量及NE活性( ±s,106/L)

表3 灌洗液中炎癥細(xì)胞含量及NE活性( ±s,106/L)

組別 n 細(xì)胞總數(shù) 巨噬細(xì)胞 中性粒細(xì)胞 淋巴細(xì)胞 單核細(xì)胞 NE(×10-3u/L)對照組 20 6.6±1.5 2.1±1.1 1.2±0.5 2.4±0.9 1.3±0.6 0.46±0.21百草枯組 20 85.4±23.3 23.8±11.3 35.3±11.1 14.2±3.2 9.7±3.1 18.35±1.57血必凈組 20 19.3±1.8 6.2±1.2 2.4±1.1 6.2±1.5 3.8±0.7 10.17±2.35

圖1 百草枯中毒組及血必凈中毒組肺組織病理檢查光鏡下比較

3 討 論

百草枯作為除草劑在我國農(nóng)村廣泛應(yīng)用。皮膚接觸、呼吸道吸入、誤服等均可造成百草枯中毒。百草枯中毒可引起多器官損害,而肺臟是百草枯中毒后主要損害的靶器官,中毒后肺組織中的百草枯濃度是血漿濃度的10～90倍。根據(jù)百草枯攝入劑量的不同,引發(fā)不同的臨床癥狀和結(jié)局。人類大劑量地?cái)z入百草枯(＞30mg/kg),引起肺出血、水腫,低氧血癥和肺泡間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤,多臟器功能衰竭,繼而死亡。百草枯中毒常引起全身炎癥反應(yīng)綜合征,進(jìn)而可造成多臟器功能衰竭,以急性肺損傷最為明顯。已證明,全身炎癥反應(yīng)綜合征是各種致病因素觸發(fā)機(jī)體產(chǎn)生過度炎癥的一種臨床過程,包括多種炎性介質(zhì)的大量釋放,導(dǎo)致抗炎反應(yīng)與致炎反應(yīng)系統(tǒng)失衡,若過度炎癥反應(yīng)繼續(xù)惡化[4],可導(dǎo)致急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、多器官障礙綜合征等。而在百草枯中毒彌漫性肺損傷的病理變化過程研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn),在中毒后1～7d為彌漫性炎癥反應(yīng)階段,肺毛細(xì)血管和小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮細(xì)胞受損,表現(xiàn)為肺水腫、出血、炎癥細(xì)胞浸潤;水腫消減后進(jìn)入后期增生階段,逐漸出現(xiàn)修復(fù)機(jī)化改變(7～14d)以及明顯纖維疤痕形成(21～45d)。因此該實(shí)驗(yàn)選擇中毒后第3天測定各炎性指標(biāo)。

Ortiz等[5]提出細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的概念,但此假說尚待進(jìn)一步完善。研究表明,百草枯中毒大鼠NF-κ B顯著升高[6],與本研究一致?，F(xiàn)已證明,NF-κ B通過參與多種細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄而對這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生復(fù)雜的影響。激活的NF-κ B可增強(qiáng)TNF-α、IL-1等眾多細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄,使炎癥細(xì)胞合成炎癥因子的時(shí)間和數(shù)量得以增高[3]。因此,NF-κ B是核內(nèi)炎性遞質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄的開關(guān),通過阻斷 NF-κ B的激活,可能有助于抑制百草枯中毒患者病情的發(fā)生與發(fā)展。從表1、2中可以看出血必凈可抑制百草枯中毒大鼠肺的 NF-κ B活性,血必凈組肺組織NF-κ B陽性細(xì)胞率、陽性細(xì)胞陽性單位均較百草枯中毒組顯著減少,從而減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,減輕炎癥介質(zhì)對肺的損傷。

機(jī)體在遭受各種嚴(yán)重?fù)p傷后可引起全身炎癥反應(yīng)綜合征,是導(dǎo)致急性肺損傷的發(fā)生的重要原因。研究表明,血必凈注射液具有對抗細(xì)菌毒素、降低內(nèi)毒素水平、拮抗炎癥介質(zhì)和改善人體免疫功能的保護(hù)性作用相結(jié)合的雙重藥理作用,與抗生素聯(lián)用有顯著提高多器官功能障礙綜合征(MODS)患者存活率的作用[7]。大量臨床資料證實(shí)血必凈注射液對膿毒癥、膿毒性休克、MODS具有減輕組織損傷,調(diào)節(jié)細(xì)胞因子平衡,從而提高存活率[7];具有對抗內(nèi)毒素及與發(fā)病有關(guān)的多種炎癥介質(zhì)的作用,能拮抗 TNF-α、內(nèi)毒素、IL-6的釋放,增強(qiáng)單核細(xì)胞人白細(xì)胞DR抗原(HLA-DR)表達(dá),促進(jìn)免疫功能恢復(fù)[8]。王靜恩等[9]研究顯示,早期給予血必凈注射液治療后,治療組 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10水平從3d起即有所下降,尤以5d時(shí)明顯下降,APACHEⅡ評分治療組也較對照組下降明顯,最終治療組膿毒癥、MODS發(fā)生率和病死率也均較對照組低。研究還表明,血必凈注射液可抑制百草枯中毒血清轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)水平,減少纖維母細(xì)胞遷移、活化,抑制膠原蛋白產(chǎn)生,保護(hù)肺組織結(jié)構(gòu),可以更有效地抑制肺纖維化、肺實(shí)變[10]。同時(shí)可降低內(nèi)毒素肺損傷大鼠血漿中肝細(xì)胞生長因子(HGF)、角細(xì)胞生長因子(KGF)的異常升高,減輕肺臟的炎癥反應(yīng),發(fā)揮對肺組織的保護(hù)作用[11]。其肺保護(hù)作用可能與抗炎作用及抑制NF-κ B活性有關(guān)。從病理檢查及表2、3可看出,血必凈注射液還可抑制百草枯中毒大鼠中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的活性及炎性細(xì)胞在肺內(nèi)聚集,對百草枯中毒所致的肺損傷具有保護(hù)作用,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。不同濃度的血必凈均能不同程度抑制炎性因子的活性,并呈劑量依賴關(guān)系,以高劑量的血必凈作用最為明顯[13]。本組大鼠均選用大劑量血必凈腹腔內(nèi)注射。

目前,百草枯中毒仍無特效治療,研究發(fā)現(xiàn),即使是輕微肺損傷仍可引起百草枯中毒患者在較長時(shí)間內(nèi)的限制性肺功能損傷,最終導(dǎo)致不可逆的肺間質(zhì)纖維化,而一旦出現(xiàn)肺間質(zhì)纖維化,患者預(yù)后極差,目前尚無確切有效的救治手段[14]。血必凈可抑制NF-κ B在大鼠肺組織中的激活,進(jìn)一步減輕炎癥介質(zhì)對急性百草枯中毒所致的急性肺損傷起到治療作用,能有效阻止急性百草枯中毒的病情進(jìn)程,減輕肺組織的病理損害。

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Protective effect of Xuebijing injection on paraquat-induced injury in rat pulmonary microvascular endothelial cells activation of NF-κ B in rats

LIU Ming-wei,LIN Xin,Zhang Ming-qian,et al.
(Departmentof Emergencey,K unming Yan′an Hospital,K unming,Yunnan 650051,China)

ObjectiveTo investigate the activity of NF-κ B of Xuebijing injection in lung tissue of acute paraquat poisoned rats.MethodsSixty rats were enrolled and randomly divided into three groups:control group,paraquat group and Xuebijing group.Peritoneal paraquat injection were performed in paraquat group and Xuebijing group,while equal volume of normal saline was peritonealy injected in control group.Three days later,the nurmber of NF-κ B positive cells,inflammatory cells,neutrophil elastase(NE)in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)and the extravascttlar lung water volume were measured.ResultsThe nurmber of NF-κ B positive cells,total cells,neutrophilic granulocytes,macrophage and NE in BALF and the extravascular lungwater volume were significantly increased in paraquat group and Xuebijing group(P＜0.05).But their levels were lower in Xuebijing group than in paraquat group(P＜0.05).ConclusionIn paraquat-induced acute lung injury rat models,Xuebijing can alleviate inflammatory response and lung injury,inhibit activity of NF-κ B and possess potential protective effects.

Xuebijing;acute lung injury;paraquat;NF-κ B

R365.595;R979.3

A

1671-8348(2010)01-0037-03

2009-04-30

2009-07-27)

·論 著·