熱水浸提法提取黃精多糖最佳工藝研究*1

孫庭閣 趙瑞萌 張 玲

(泰山醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系，山東 泰安 271016)

泰山黃精(PolygonatumsibiricumRed)屬百合科多年生草本植物，藥用部分為根莖。因其獨(dú)特的生長(zhǎng)環(huán)境和氣候條件在全國(guó)多種黃精中被譽(yù)為上品[1]。本實(shí)驗(yàn)所用的泰山黃精為樓臺(tái)黃精，又名重樓黃精或雞頭黃精，為泰山正品[2]。黃精以根莖入藥，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎之功能。臨床上用于治療脾胃虛弱、體倦乏力、口干食少、肺虛燥咳、精血不足及內(nèi)熱消渴等癥[3]。研究表明，泰山黃精主要含多糖、低聚糖、黃精皂苷、氨基酸、黃酮及微量元素等，其中黃精多糖是黃精化學(xué)組成的一個(gè)重要部分[4]。現(xiàn)代藥理研究表明, 黃精多糖具有多種生物學(xué)功能[5]。由于多糖不溶于60%以上乙醇，也不溶于氯仿和正丁醇，所以傳統(tǒng)上用熱水提取多糖，乙醇沉淀除去部分醇溶性雜質(zhì)[6]?？紤]到熱水浸提多糖影響因素較多，所以本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)比較了不同的提取次數(shù)、提取溫度、浸提時(shí)間、固液比對(duì)黃精多糖提取率的影響，以期篩選出一種高效、經(jīng)濟(jì)的提取方法，為實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器

AB265-S 61G/220電子分析天平(瑞士，梅特勒-托利多)； DJ-500A電子天平( 亞太公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)BMH)；UV=755B紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(江蘇省宜興市儀器儀表總廠)；離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；KQ-600DB數(shù)控大型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CHN-86801奧立龍酸度計(jì)。

1.2 材料與試劑

黃精采自泰山，經(jīng)泰山醫(yī)學(xué)院中藥教研室鑒定為泰山正品雞頭黃精(PolygonatumsibiricumRed)。苯酚、濃硫酸、葡萄糖、無(wú)水乙醇、蒸餾水、氯仿、正丁醇等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 試劑的配制

2.1.1NaOH溶液的配制 用電子分析天平精密稱取1.0000 g、2.0000 g、3.0000 g、10.0000 g固體氫氧化鈉，用蒸餾水充分溶解后，置容量瓶中定容至100 ml,顛倒混勻，即得1%、2%、3%、10%NaOH溶液。

2.1.2Sevag試劑的配制 氯仿與正丁醇按1︰4比例混合即得(現(xiàn)用現(xiàn)配)。

2.1.3苯酚溶液的配制 取適量苯酚(餾分好的),取此餾分15.00 g,用蒸餾水充分溶解后，置250 ml容量瓶中, 定容至刻度，搖勻，置于棕色瓶中,冷藏備用。

2.1.4葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 稱取105℃干燥至恒重(前后兩次質(zhì)量差小于2 mg)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1002 g, 置于100 ml 容量瓶中, 加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，取10 ml稀釋到50 ml作為標(biāo)準(zhǔn)使用液備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取上述配制好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 ml，分別置于10 ml具塞試管中，依次加蒸餾水使其總體積均達(dá)到2 ml, 然后依次加入6% 苯酚溶液1.0 ml，充分混勻, 迅速加入5.0 ml 濃硫酸(加濃硫酸時(shí), 勿沿壁加入, 應(yīng)將移液管口懸于試管口, 使?jié)饬蛩岽怪睕_入液面),混勻，放置5 min，沸水浴加熱15 min，取出后冷卻至室溫。另以2.0 ml蒸餾水作為空白對(duì)照，所有操作均與上述相同，測(cè)定490 nm 下吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo), 葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A = 0.0136C, R2=0.9842。

2.3 黃精多糖的提取工藝流程

鮮黃精根塊洗凈烘干至恒重后粉碎，分別過(guò)20，60，100目篩→加入適量蒸餾水→適宜溫度提取兩次→合并提取液→過(guò)濾→離心→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→Sevag試劑脫蛋白→活性炭脫色→濃縮→乙醇沉淀→洗滌沉淀→真空干燥黃精多糖。

2.4 換算因子的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取已干燥至恒重的自制黃精多糖0.1000 g,置于50 ml干凈燒杯中，用少量蒸餾水溶解，完全轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，最后用蒸餾水定容，再準(zhǔn)確吸取該溶液1 ml于10 ml容量瓶中，蒸餾水定容，混勻用作儲(chǔ)備液。精密移取該溶液2.0 ml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖中葡萄糖的濃度，按公式計(jì)算換算因子：F=W/(C·D)。W為多糖質(zhì)量(mg)，C為多糖中葡萄糖的濃度(mg/ml)，D為多糖的稀釋倍數(shù)。

2.5 多糖含量的測(cè)定

精密吸取黃精多糖樣品溶液1 ml，按照測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液同樣的方法測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和換算因子，按下公式計(jì)算樣品中多糖的百分含量：多糖含量(%)=C·D·F/W，公式中C為供試液中葡萄糖的濃度(mg/ml)，D代表供試液中多糖的稀釋倍數(shù)，F(xiàn)為換算因子，W為供試品的質(zhì)量(mg)。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了選取提取黃精多糖的最佳條件，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度、熱水浸提時(shí)間、固液比和提取次數(shù)4項(xiàng)為考察因素，各取3個(gè)水平，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(43)，不考慮各因素間的相互影響。因素-水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 水提醇析法提取黃精多糖的正交實(shí)驗(yàn)表

2.7 回收率測(cè)定

精密稱取黃精干粉三份，每份5 g，依次加入10、20、30 mg葡萄糖，按照上述篩選的最佳條件提取多糖，并按照測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的方法測(cè)定多糖含量，根據(jù)公式計(jì)算加標(biāo)回收率：P=(Xi-X0)/m×100%，公式中P為加入的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率，m為加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量，Xi為加標(biāo)樣品的測(cè)定值，X0為未知樣品的測(cè)定值。計(jì)算得平均回收率97.5%，RSD為2.07%。

2.8 顯色穩(wěn)定性測(cè)定

取黃精多糖供試溶液, 依法顯色后, 在30、60、90、120 min測(cè)定其吸光度，結(jié)果表明，在120 min內(nèi)測(cè)定，多糖溶液顯色穩(wěn)定，吸光度變化不大。

2.9 正交實(shí)驗(yàn)提取黃精多糖的測(cè)定結(jié)果 見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)提取黃精的測(cè)定結(jié)果

注：因素主次順序?yàn)锳CDB，最佳條件為A2B3C1D2

從表2的直觀分析可以看出，極值R反應(yīng)了4個(gè)因素對(duì)多糖提取含量的影響RA>RC>RD>RB,即熱水浸提黃精多糖的因素主次關(guān)系為ACDB，最佳條件為A2B3C1D2。即因素主次關(guān)系：提取溫度>料液比>提取次數(shù)>時(shí)間，最佳條件為溫度80℃，時(shí)間120 min, 料液比1︰15, 提取次數(shù)2次。

3 討 論

熱水浸提是提取分離黃精多糖的傳統(tǒng)方法, 其影響因素較多，主要有提取時(shí)間、水提溫度、提取次數(shù)及固液比等，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熱水溫度和固液比是影響水提醇析法提取黃精多糖的主要因素，分別達(dá)到了顯著性水平，提取時(shí)間影響相對(duì)較小，即因素主次關(guān)系：提取溫度>固液比>提取次數(shù)>提取時(shí)間。在本實(shí)驗(yàn)條件下，熱水浸提黃精多糖的最佳條件為溫度80℃，時(shí)間120 min, 料液比1︰15, 提取次數(shù)2次。

[1] 李元富，張義濤，劉道富.泰山藥用植物[M].中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,1996,(10):245.

[2] 畢研文，宮俊華，楊永恒.泰山黃精藥用價(jià)值和栽培技術(shù)[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006,12(8):86-87.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典2000年版(一部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2000:252.

[4] 中華本草編委會(huì).中華本草第八卷[M].上海：上?？萍汲霭嫔?， 1999：142.

[5] 石林, 蒙義文，李偉.黃精及黃精多糖的藥理研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，1999.11(3)： 67-71.

[6] 楊文遠(yuǎn)，郭偉，王天勇.寧夏黃精中黃精多糖的分離提取和測(cè)定[J].寧夏大學(xué)學(xué)報(bào),1997,18 (2):359-360.