張 良 呂雷立 桑 慧 王 寧 楊娜娜
(1. 泰山醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系,山東 泰安 271000 ; 2. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織與胚胎學(xué)教研室,廣州 汕頭 515041 ;3. 泰山醫(yī)學(xué)院動(dòng)脈粥樣硬化研究所,山東 泰安 271000)
2型糖尿病在我國(guó)有患者2000萬(wàn)以上,嚴(yán)重危害人類的健康。其發(fā)病機(jī)制主要為胰島素抵抗,有證據(jù)表明胰島素抵抗由多種內(nèi)在因素決定,且能被個(gè)體遺傳給后代。胰島素抵抗可見于胰島素受體基因的突變,但事實(shí)上,2型糖尿病患者鮮有發(fā)生胰島素受體基因突變的案例。近年來(lái),科研工作者在2型糖尿病患者的肌肉、皮膚和脂肪組織中發(fā)現(xiàn)了一種高度表達(dá)名為核苷酸內(nèi)焦磷酸酶/磷酸二酯酶1 (ENPP1)的糖蛋白,ENPP1通過(guò)結(jié)合胰島素受體α亞基引起胰島素受體酪氨酸蛋白磷酸化水平的降低,進(jìn)而阻礙胰島素信號(hào)的傳導(dǎo)[1]。ENPP1基因的編碼區(qū)具有多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn),其121Q等位基因可以提高ENPP1對(duì)胰島素受體的阻礙作用[2]。近年來(lái),學(xué)者們研究了ENPP1基因K121Q多態(tài)性和2型糖尿病在不同人群中的關(guān)系,并且得到了許多具有爭(zhēng)議的結(jié)論,因此我們采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法來(lái)研究ENPP1基因K121Q多態(tài)性和泰安地區(qū)人群2型糖尿病的相關(guān)性。
研究對(duì)象均為山東泰安地區(qū)漢族人群。2型糖尿病患者100例,男52例,女48例,年齡(56.4±12.1)歲,所有病例之間均無(wú)血緣關(guān)系。診斷按照1997ADA推薦標(biāo)準(zhǔn),即空腹血糖≥7.0 mmol/L和(或)負(fù)荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L,排除空腹血糖受損及口服糖耐量異常。所有樣本均由泰安市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科提供。健康對(duì)照者150例,男78例,女72例,年齡(55.2 ±15. 1)歲。
1.2.1基因提取與PCR-RFLP 基因組DNA提取采用TIANGEN公司全血基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行。根據(jù)Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物序列如下:上游:5'-CTGTGTTCACTTTGGACATGTTG-3',下游:5'-GACGTTGGAAGATACCAGGTTG-3',擴(kuò)增片段為238 bp。擴(kuò)增50 μl體系。反應(yīng)程序:95℃變性 30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。 PCR反應(yīng)結(jié)束后,2%的瓊脂糖凝膠上電泳30 min,觀察結(jié)果。瓊脂糖凝膠DNA回收采用SOLARBIO公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒?;厥蘸笥孟拗菩詢?nèi)切酶AvaⅡ酶切DNA,10 μl酶切反應(yīng)體系,30℃溫育1 h后,在2%瓊脂糖凝膠上電泳20 min,在凝膠成像分析系統(tǒng)內(nèi)觀察結(jié)果并采圖。
1.2.2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)算基因型頻率和等位基因頻率,以Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)研究對(duì)象的群體代表性,采用χ2檢驗(yàn)比較組間基因型頻率和等位基因頻率的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
將酶切產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳20 min,在BIO-BAD凝膠成像系統(tǒng)下觀察,未變異的純合子電泳僅見238 bp一條帶(基因型為KK);變異的純合子可顯示148 bp和90 bp兩條帶(基因型為QQ);變異的雜合子電泳帶型見238 bp、148 bp及90 bp三條帶(基因型為KQ)。如圖1。
圖1 酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖
注:M為Marker;1,2分別為KQ,KK基因型。
基于我們所篩選的研究對(duì)象,在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中沒有出現(xiàn)QQ基因型。
分別對(duì)病例組和對(duì)照組的基因型頻率進(jìn)行遺傳平衡檢驗(yàn),χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)際數(shù)與理論數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(病例組:χ2=0.313,P=0.855;對(duì)照組:χ2=0.648,P=0.723) , 病例組和對(duì)照組基因型頻率符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律,具有群體代表性。
2型糖尿病組與對(duì)照組ENPP1基因K121Q基因型和等位基因頻率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)見表1,2 。
表1 兩組基因型的構(gòu)成
注:χ2=0.158,P=0.691。
表2 兩組等位基因的構(gòu)成
注:χ2=0.148,P=0.693 。
我們使用居住在泰安的100例無(wú)血緣關(guān)系的2型糖尿病患者和150例健康對(duì)照者進(jìn)行病例對(duì)照研究,來(lái)探討ENPP1基因K121Q多態(tài)性的分布情況,結(jié)果沒有在2型糖尿病患者和健康對(duì)照者之間發(fā)現(xiàn)基因型頻率和等位基因頻率的顯著差別。
Mastsuoka N等[3]研究表明對(duì)于高加索人群和非洲裔美國(guó)人群等位基因Q與2型糖尿病的發(fā)生無(wú)關(guān),同時(shí)他的研究證明了等位基因K而非等位基因Q 與肥胖的發(fā)生有關(guān)。Lyon HN等[4]通過(guò)對(duì)2873例歐洲裔美國(guó)人和波蘭人,188例非洲裔美國(guó)人,和以家庭為單位的866例非洲裔美國(guó)人所進(jìn)行的研究,未發(fā)現(xiàn)ENPP1基因K121Q多態(tài)性與2型糖尿病和體重指數(shù)(BMI)有任何相關(guān)性。 通過(guò)對(duì)生活在英國(guó)的8089例高加索人群[5]進(jìn)行的研究,未發(fā)現(xiàn)ENPP1基因K121Q的多態(tài)性與2型糖尿病的遺傳易感性有關(guān)聯(lián)。Grarup N等[6]研究發(fā)現(xiàn)ENPP1基因K121Q多態(tài)性與丹麥白種人患2型糖尿病之間無(wú)顯著相關(guān)性,而121QQ基因型與過(guò)度肥胖(BMI>25)之間具有顯著相關(guān)性;Keshavarz P 等[7]報(bào)道日本人群中攜帶ENPP1基因變異體的人患2型糖尿病危險(xiǎn)性并未增加。以上學(xué)者的研究結(jié)論和我們的結(jié)論相同。然而仍然有部分學(xué)者和我們持有相反的結(jié)論。Bacci S[8]通過(guò)對(duì)2834例2型糖尿病患者和4425例健康對(duì)照者進(jìn)行的病例對(duì)照研究,報(bào)道ENPP1基因K121Q多態(tài)性和胰島素抵抗以及2型糖尿病患者動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。 Meyre D[9]進(jìn)行了一項(xiàng)針對(duì)法國(guó)人和澳大利亞人的研究,使用了1255例2型糖尿病患者和1314例健康對(duì)照者,得出了K121Q的等位基因Q和2型糖尿病的發(fā)生有關(guān)聯(lián)的結(jié)論。Nicola Abate[10]對(duì)三種不同人群(包括679例生活在印度的土著居民,1083例生活在達(dá)拉斯和卡薩斯的南亞移民,以及858例生活在達(dá)拉斯和卡薩斯的土著高加索居民)進(jìn)行了深入研究,證明了在南亞人群和高加索人群中ENPP1基因K121Q的多態(tài)性與2型糖尿病的遺傳易感性有關(guān)聯(lián)。
基于本研究所篩選的研究對(duì)象以及獲得的研究結(jié)果,我們初步得出結(jié)論ENPP1基因K121Q多態(tài)性和山東泰安地區(qū)人群2型糖尿病沒有顯著相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)由于所采取的樣本量較少,為了進(jìn)一步排除該基因與2型糖尿病的相關(guān)性,還應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,并結(jié)合病人各項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行分析。
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山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)學(xué)報(bào)2010年2期