多重耐藥銅綠假單胞菌Ⅰ類整合酶基因研究*

孫慧清

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰安醫(yī)院，山東 泰安 271000)

銅綠假單胞菌(Pa)為條件致病菌，近年來(lái)已成為醫(yī)院感染的主要病原菌之一[1]。其多重耐藥已是臨床抗感染化療的難題。近年國(guó)內(nèi)外學(xué)者從細(xì)菌中已檢出Ⅰ型整合酶基因的菌株。Pa菌的Ⅰ型整合酶基因(intⅠ1)國(guó)內(nèi)已有報(bào)道[2，3]。該研究探討臨床分離的MRPA耐藥性及Ⅰ類整合酶基因存在狀況及特點(diǎn)，為臨床合理應(yīng)用抗生素治療Pa感染性疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 68株MRPA來(lái)自我院2006年1月—2007年5月臨床各類標(biāo)本，這些菌株主要來(lái)自重癥監(jiān)護(hù)病房。

1.2菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 全部菌株使用法國(guó)梅里埃ATB細(xì)菌鑒定儀鑒定菌種。采用K—B紙片擴(kuò)散法和微量稀釋法測(cè)定對(duì)慶大霉素(GEN)、亞胺培南(IMP)、哌拉西林(PIP)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢他啶(CAZ)、美羅培南(MEM)、氨曲南(ATM)、阿米卡星(AK)、左氧氟沙星(LEV)、奈替米星(NET)、頭孢曲松(CRO)、環(huán)丙沙星(CIP)、頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、頭孢哌酮(CFP)、妥布霉素(TOB)等16種抗生素進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，并根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)2004年版要求進(jìn)行抗菌藥物敏感性判斷。質(zhì)控菌株:銅綠假單胞菌ATCC27853購(gòu)于山東省臨床檢驗(yàn)中心。如果亞胺培南、環(huán)丙沙星、頭孢他啶或頭孢吡肟或氨曲南、奈替米星等4種藥物達(dá)到3種或以上耐藥就為多重耐藥株[6]。

1.3Ⅰ類整合酶基因檢測(cè) 引物參照[4]用PCR法，采用蛋白酶K消化法提取細(xì)菌DNA。基因擴(kuò)增引物、TaqDNA酶和dNTPs由大連寶生物工程有限公司提供。PCR擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1。

1.4PCR擴(kuò)增 PCR體系(50 μl):10×緩沖液5 μl，dNTPs mixture(2.5 mmol/L) 4 μl，引物(25 μmol/L)1 μl, 模板各1 μl, Taq酶0.5 μl 。反應(yīng)條件：93℃預(yù)變性2 min, 94℃變性60 s, 55℃退火60 s, 72℃延伸60 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)72℃延長(zhǎng)至5 min。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

2 結(jié) 果

2.1抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 68株MRPA對(duì)16種抗菌藥物的敏感性，見(jiàn)表2。

2.21型整合酶基因檢測(cè)結(jié)果 68株MRPA菌株intI 1基因均陽(yáng)性，陽(yáng)性率100%。intI 1 PCR產(chǎn)物電泳圖，見(jiàn)圖1 。

表2 68株MDRPA對(duì)16種抗菌藥物的藥敏率(%)

圖1 intI 1基因PCR電泳圖

3 討 論

銅綠假單胞菌廣泛分布于自然界，是醫(yī)院感染最常見(jiàn)的革蘭陰性桿菌之一，在臨床的抗感染治療過(guò)程中，容易對(duì)臨床常用的抗生素產(chǎn)生耐藥性，且耐藥機(jī)制復(fù)雜。Ⅰ型整合子是造成Pa耐藥傳播的重要原因[5]。整合子是一種基因片段，具有位點(diǎn)特異性重組功能的基因決定子，能識(shí)別并俘獲移動(dòng)性基因盒，基因盒是整合子上所攜帶的基因片段，常攜帶耐藥基因。整合子對(duì)耐藥基因的捕獲和擴(kuò)散導(dǎo)致了臨床上多重耐藥菌株進(jìn)化。在整合子介導(dǎo)的耐藥機(jī)制中，Ⅰ類整合子起著非常重要的作用。本研究68株MRPA中， intI 1基因均陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)100%。表明多重耐藥銅綠假單胞菌攜帶Ⅰ類整合酶基因陽(yáng)性率很高。68株MRPA對(duì)阿米卡星和頭孢他啶的耐藥率分別為14.7%和29.4%，對(duì)其他抗菌藥物耐藥率分別在61.8%～100%之間，呈高比例耐藥。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)沒(méi)有接觸過(guò)抗生素的病原菌也會(huì)出現(xiàn)對(duì)抗生素的抗性，直到Hall等[6]發(fā)現(xiàn)了整合子。整合子是一個(gè)與耐藥基因水平傳播有關(guān)的新的可移動(dòng)基因元件，整合子在細(xì)菌耐藥性傳播中起非常重要的作用，其中Ⅰ類整合子是造成銅綠假單胞菌耐藥傳播的重要原因[7],一旦細(xì)菌對(duì)新抗生素產(chǎn)生抗性基因，這些抗性基因就能夠通過(guò)整合子的傳遞，形成對(duì)新抗生素的普遍抗性[8]。因此應(yīng)合理使用抗生素，延緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生是我們今后關(guān)注的重點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

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[8] 許紅濤 陳東科 張秀珍. 多重耐藥銅綠假單孢菌中Ⅰ類整合子的研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志， 2005,28(7):721-723.