137個(gè)遺傳性聾小家系的聾病分子流行病學(xué)研究

鮑曉林 郭玉芬 劉曉雯 徐百成 郭家亮 孫薔

1 天津市泰達(dá)醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(天津 300457)； 2 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

目前普遍認(rèn)為GJB2基因、線粒體DNA 12SrRNA A1555G和SLC26A4基因是最常見(jiàn)的遺傳性致聾因素，本研究對(duì)西北地區(qū)137個(gè)小家系中的耳聾患者進(jìn)行了這三種基因的突變檢測(cè)，旨在探索其耳聾的發(fā)病機(jī)制，為預(yù)防和治療耳聾提供依據(jù)，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 中國(guó)西北地區(qū)有明確遺傳家族史的137個(gè)核心家系的170例耳聾患者，其中男112例，女58例，年齡6～24歲。其中單一患者家系106個(gè)，雙患者家系29個(gè)，三患者家系2個(gè)。

1.2 調(diào)查方法

1.2.1 填寫問(wèn)卷調(diào)查表 根據(jù)王秋菊等[1]提出的遺傳性聾資源的收集、保存的方法進(jìn)行聾病流行病學(xué)調(diào)查，主要包括患者耳聾的發(fā)生年齡、發(fā)病方式、耳聾的程度、感染史、發(fā)育史、母親的妊娠及分娩史、有無(wú)耳毒性藥物用藥史、有無(wú)耳聾高危新生兒疾病史以及有無(wú)其他系統(tǒng)疾病等[1～3]。詳細(xì)了解家系中有無(wú)耳聾及聾啞患者與先證者的關(guān)系。

1.2.2 全身及耳鼻咽喉科常規(guī)檢查[3]在進(jìn)行全身及耳鼻咽喉科檢查時(shí)，特別注意全身發(fā)育、眼部及甲狀腺的檢查以初步排除綜合征型聾，排除因中耳炎、腦膜炎、病毒性腦炎、腮腺炎及全身感染等因素所致的耳聾。

1.2.3 繪制家系譜圖 采集家系成員的親緣關(guān)系背景資料，從先證者出發(fā)，追溯家庭成員的親緣關(guān)系，結(jié)合病史資料和臨床聽(tīng)力學(xué)檢測(cè)，應(yīng)用Cyrillic軟件繪制家系譜圖，確定遺傳方式。

1.2.4 聽(tīng)力學(xué)檢測(cè)與評(píng)估 按照WHO(1997年)聽(tīng)力損失分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)：25～40 dB HL為輕度聾，41～60 dB HL為中度聾，61～80 dB HL為重度聾，>81 dB HL為極重度聾。應(yīng)用Madsen901(丹麥)聲導(dǎo)抗檢測(cè)儀進(jìn)行鼓室壓力及鐙骨肌反射的檢測(cè)，應(yīng)用美國(guó)智聽(tīng)公司Smart EP 3.X聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位儀進(jìn)行聽(tīng)性腦干反應(yīng)檢測(cè)，測(cè)定閾值及判斷是否存在蝸后病變，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行耳聾表型的分類。

1.2.5 血樣采集 所有聾啞學(xué)生及家系成員簽寫知情同意書后，抽取靜脈血5～10 ml，用酚氯仿法提取白細(xì)胞DNA。

1.3 基因擴(kuò)增 采用王秋菊課題組[4]針對(duì)GJB2基因和SLC26A4基因的編碼區(qū)、線粒體DNA12SrRNA設(shè)計(jì)的共22對(duì)引物序列、反應(yīng)條件和反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)體系在ABI公司9700熱循環(huán)儀完成。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取每種PCR產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)Marker各2 μl，分別加入6 μl溴酚藍(lán)，用1.1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行產(chǎn)物純度和濃度的檢測(cè)。

針對(duì)線粒體DNA12SrRNA1555位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后分別取6 μl，加入Alw26l限制性內(nèi)切酶0.2 μl，6×Buffer 2 μl，加水至20 μl，在37℃水浴箱中溫育消化3小時(shí)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，酶切切開(kāi)者為300 bp和500 bp兩個(gè)條帶，而不能切開(kāi)的則為800 bp的一個(gè)條帶，不能切開(kāi)的或是酶切顯示不清的送測(cè)序驗(yàn)證。

按照Coyle等[5]和趙亞麗等[6]設(shè)計(jì)的20對(duì)引物對(duì)SLC26A4基因21個(gè)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后直接應(yīng)用ABI公司3730型DNA分析儀測(cè)序。測(cè)序引物與PCR擴(kuò)增引物相同；測(cè)序結(jié)果應(yīng)用DNA Star5.0、Bioedit等軟件包進(jìn)行分析，通過(guò)ClustalX、BLAST軟件進(jìn)行序列比對(duì)、多物種蛋白的進(jìn)化研究和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病年齡 在170例聾啞學(xué)生中，以2歲為分界線，語(yǔ)前聾患者119例，語(yǔ)后聾患者21例，其余30例患者不能明確其發(fā)病年齡。

2.2 聽(tīng)力檢測(cè)結(jié)果 170例(340耳)中，重度聽(tīng)力損失46耳，極重度聽(tīng)力損失294耳，均為雙側(cè)感音神經(jīng)性聾。

2.3 遺傳方式 137個(gè)家系中，常染色體隱性遺傳方式102個(gè)(74.45%,102/137)，母系遺傳方式13個(gè)，其余22個(gè)家系不能明確遺傳方式。

2.4 單一患者家系基因檢測(cè)結(jié)果 106個(gè)單一患者家系中，GJB2基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純合突變5例(235delC 4例、416G>A 1例)，1例235delC與299-300delAT復(fù)合雜合突變，雜合突變4例(235delC 3例、299-300delAT 1例)。只檢測(cè)到79G>A 、109G>A、341A>G、368C>A和608T>C等遺傳多態(tài)改變的有49例，無(wú)突變的47例。線粒體DNA12SrRNA1555位點(diǎn)同質(zhì)型突變的有14例。SLC26A4基因共發(fā)現(xiàn)純合突變6例，基因型為IVS7-2A>G/IVS7-2A>G 5例，1181InsG/1181InsG 1例；復(fù)合雜合突變3例，分別為1229C>T/wt與1982A>G/wt雜合突變2例，基因型分別為IVS7-2A>G與2027T>A/wt和2027T>A/wt(典型測(cè)序圖見(jiàn)圖1～3)。

圖1 299-300delAT純合突變(上)、野生型(中)、雜合突變(下)

圖2 mtDNA12SrRNA1555異質(zhì)型突變(上)、同質(zhì)型(中)、正常測(cè)序圖(下)

圖3 SLC26A4第8內(nèi)含子剪接點(diǎn)正常(上)、雜合(中)IVS7-2A>G突變純合(下)

2.5 雙患者及三患者家系基因檢測(cè)結(jié)果 31個(gè)家系共64個(gè)患者中，GJB2基因235delC純合突變5例、235delC雜合突變5例；299-300delAT純合突變4例，17例為良性多態(tài)改變，33個(gè)未檢測(cè)到突變。線粒體DNA12SrRNA1555位點(diǎn)同質(zhì)型突變的2例。SLC26A4基因僅檢測(cè)到5例雜合突變，基因型分別為 IVS7-2A>G/wt 3例，2162C>T/wt(T721M)和2168A>G/wt(H723R)各1例?；蛐屯耆嗤膬H有3個(gè)，有16個(gè)家系三種基因都未檢測(cè)到突變。

GJB2基因、線粒體DNA12SrRNA 1555位點(diǎn)和SLC26A4基因的突變率分別為14.11%(24/170)、9.41%(16/170)和8.82%(15/170)。

2.6 對(duì)單一患者家系和雙患者家系GJB2基因、線粒體DNA12SrRNA1555位點(diǎn)和SLC26A4基因三種常見(jiàn)致病基因突變率比較 單一患者家系和雙患者家系之間的線粒體DNA12SrRNA和SLC26A4基因突變率的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為1.689、4.758和10.780，P值分別為0.430、0.029和0.000)，證實(shí)聾病基因存在遺傳聚集和遺傳易感的特性。

3 討論

家系資源能夠帶來(lái)比散發(fā)病例更集中的遺傳信息，而且很大程度上減少了環(huán)境因素、遺傳異質(zhì)性因素的影響。通過(guò)對(duì)家系的研究，不僅能夠進(jìn)行基因定位、基因診斷，還可以獲得更多的有關(guān)基因調(diào)控等基因功能和基因互作方面的信息，解釋發(fā)病機(jī)制，最終達(dá)到疾病預(yù)防和基因治療的目的。

本研究137個(gè)小家系中GJB2基因突變發(fā)生率最高，占所有致病突變的43.64%(24/55)，證實(shí)GJB2基因也是西北地區(qū)遺傳性聾人群中最常見(jiàn)的致病基因。線粒體DNA12SrRNA A1555G和SLC26A4基因突變率分別為29.09%(16/55)和27.27%(15/55)。而線粒體DNA12SrRNA的1555位點(diǎn)的突變占所有突變的29.09%(16/55)，是發(fā)生純合突變最多的位點(diǎn)，體現(xiàn)了藥物性聾仍然是西北地區(qū)最常見(jiàn)的致聾病因，說(shuō)明當(dāng)前濫用耳毒性藥物的問(wèn)題依舊非常嚴(yán)重。GJB2基因的235delC純合突變占16.36%(9/55)，與大前庭水管綜合征相關(guān)的IVS7-2A>G純合突變占9.09%(5/55)，而GJB2基因299-300delAT純合突變占7.27%(4/55)，依次排在第2位到第4位。在31個(gè)雙患者或三患者的家系中，有9個(gè)家系GJB2基因檢測(cè)到雙等位基因突變，4個(gè)家系檢測(cè)到了SLC26A4的雜合突變，2個(gè)mtDNA12SrRNA 1555位點(diǎn)的同質(zhì)型突變，所有家系中基因型完全相同的僅有3個(gè)，有16個(gè)家系三種基因都未檢測(cè)到突變。本研究有74.45%的家系明確為隱性遺傳，并且為23.53%(40/170)的患者明確了耳聾的分子病因(純合和復(fù)合雜合突變)，體現(xiàn)了基因診斷的意義所在。然而還有8.82%(15/170)的患者僅檢測(cè)到單一位點(diǎn)的基因突變，67.65%(115/170)的患者未檢測(cè)到任何突變，這些耳聾患者通過(guò)現(xiàn)有的研究水平還無(wú)法做出分子診斷，需要不斷的探索和研究。

耳聾遺傳學(xué)相關(guān)研究的不斷深入，是為了探索耳聾的發(fā)病機(jī)制，實(shí)現(xiàn)預(yù)防和治療耳聾的最終目的。通過(guò)遺傳咨詢和婚配指導(dǎo)可以有效的避免兩個(gè)攜帶相同致病基因突變的人婚配，從而降低子代遺傳性聾的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)該是目前最經(jīng)濟(jì)、有效而且容易推廣的手段[7]。氨基糖苷類藥物性聾與線粒體DNA 12SrRNA A1555G 突變密切相關(guān)[8～10]，避免應(yīng)用氨基糖苷類藥物可以為子孫后代帶來(lái)福音。SLC26A4基因突變與前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大密切相關(guān)，通過(guò)避免外傷震蕩、預(yù)防病毒感染等手段完全可以延緩耳聾的進(jìn)展。對(duì)學(xué)語(yǔ)前的嬰幼兒可以早期發(fā)現(xiàn)聾病危險(xiǎn)因素，采取必要的預(yù)防措施，從而保證言語(yǔ)語(yǔ)言功能的發(fā)育，實(shí)現(xiàn)聾而不啞。

1 王秋菊，楊偉炎，韓東一，等.遺傳性耳聾資源的收集、保存及利用——綜合系統(tǒng)的建立[J].中華耳科學(xué)雜志，2003，1：65.

2 Stephens D, Lewis P, Davis A. The epidemiology of hearing problem: How should we investigate it[J].Acta Otolaryngol, 2004, 522(suppl):13.

3 謝鼎華，楊偉炎.耳聾的基礎(chǔ)與臨床[M].長(zhǎng)沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社,2003.344～355.

4 李慶忠，王秋菊，遲放魯，等.中國(guó)散發(fā)聽(tīng)力損失患者中GJB2基因突變分子流行病學(xué)研究[J]. 中國(guó)眼耳鼻喉科雜志，2006，5：310.

5 Coyle B,Reardon W,Herbrick JA, et al, Molecular analysis of the SLC26A4 gene in Pendred syndrome[J]. Hum Mol Genet, 1998,7:1 105.

6 趙亞麗，李慶忠，翟所強(qiáng)，等. 國(guó)人前庭水管擴(kuò)大患者SLC26A4基因的特異性突變[J]. 聽(tīng)力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志, 2006,14:93.

7 劉曉霞，郭玉芬，韓東一，等.非綜合征型聾患者線粒體DNAA1555G突變頻率分析[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2007，39：739.

8 Li XM，Guan MX．A human mitochondrial GTP binding protein related to tRNA modification may modulate phenotypic expression of the deafness—associated mitochondrial 12S rRNA mutation[J]．Molecular and Cellular Biology，2002，22：7 701.

9 趙立東，王秋菊，郭維維，等.與線粒體DNAA1555G突變有關(guān)的非綜合征型耳聾[J].中華耳科學(xué)雜志,2004，2：136.

10 11 趙蘇瑛,張海軍,徐春宏，等.核基因參與人類線粒體12S rRNA突變相關(guān)非綜合征耳聾的臨床表型[J].分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào)，2006，1：39.