頜下徑路阻塞咽鼓管創(chuàng)建大鼠分泌性中耳炎模型△

喬振花 戴艷紅 徐琳 佘萬東

分泌性中耳炎(otitis media with effusion,OME)最常見病因為咽鼓管阻塞或功能不良。國內外有數(shù)種方法創(chuàng)建OME模型用于研究該疾病，但國內創(chuàng)建模型的方法多為經鼓膜直接注射致病因子，誘發(fā)感染及變態(tài)反應導致中耳積液的產生[1]，也有經手術切斷顎帆張肌和翼突鉤，或切斷支配它的三叉神經分支等破壞咽鼓管的功能以誘發(fā)中耳積液產生的方法[2]。本研究擬經頜下徑路阻塞咽鼓管骨性部分以非化學方法建立OME動物模型，旨在為研究OME可能導致的內耳損傷提供無化學因素干擾的動物模型。

1 材料與方法

1.1動物選擇及模型建立[3]選擇清潔級雄性SD大鼠24只，2月齡，體重180～220 g,南京大學附屬鼓樓醫(yī)院實驗動物中心提供。所有動物耳廓反射靈敏，耳鏡檢查外耳道清潔，鼓膜標志清晰，ABR和聲導抗檢測正常。右耳為實驗組(n=24)，左耳為空白對照組(n=24)。取每只大鼠右側耳手術造模，2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉,將麻醉好的動物仰臥位安置于手術臺上，剃去頸部的毛發(fā)，皮膚用1%聚維酮碘溶液消毒。在下頜弓下0.5 cm處作一與下頜弓平行、1.5～2.0 cm長的橫形切口，鈍性分離皮下組織，暴露右側聽泡腹側面。確認咽鼓管的骨性部分后，在其上鉆孔，并用消毒過的直徑1～2 mm的木塞阻塞該孔(圖1)，術后用75%酒精溶液消毒切口并縫合，在電烤燈下保溫直至動物完全從麻醉中清醒,隨后送至籠中飼養(yǎng)。術后常規(guī)肌肉注射青霉素5天(20萬U·kg-1·d-1)。于術后14、21、30、60 d分別行雙側ABR及聲導抗檢測,以ABR閾值升高、出現(xiàn)“B”型鼓室導抗圖作為OME造模成功的客觀依據，在耳內鏡下觀察鼓膜，并排除術后乳突炎和化膿性中耳炎的動物。

1.2ABR檢測 測試在隔聲屏蔽室進行。2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射，采用頭皮針形電極，記錄電極置于顱頂中線，參考電極置給聲側耳后，零極置鼻根部。短聲刺激，經耳機給聲，刺激頻率為13.1次/秒，帶通濾波150～1 500 Hz，疊加次數(shù)為1 024次，記錄時程10 ms。記錄ABR反應閾及90 dB SPL聲刺激時ABR波I、III潛伏期及Ⅰ-Ⅲ波間期。以波Ⅲ作為判斷反應閾的依據。

1.3聲導抗測試 以2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，待充分麻醉后，清除外耳道耵聹。應用與郭志強等[4]相似的方法即：應用GSI-33VersionⅡ型中耳分析儀做鼓室導抗圖測試，將內徑約2 mm自制橡膠探頭套于與之匹配的嬰兒探頭之外，使之可與大鼠外耳道完全密封。將大鼠頭部用自制頭架固定，探測音為226 Hz、85 dB SPL,壓力變化范圍從+200 daPa～-400 daPa,壓力變化速度400 daPa/s, 圖上直接讀出聲導納值(ml)、峰值(daPa)、耳道容積值(ml)及梯度值(daPa)。圖型按Linen/Jerger分類法[5]分類。

1.4中耳粘膜標本制作 將測得B型曲線后的動物麻醉后固定，心內灌注4℃4%多聚甲醛,斷頭，取雙側聽泡，聽泡用4℃4%多聚甲醛灌注，石蠟包埋、切片機切片,常規(guī)脫蠟后行HE染色,光鏡下觀察。

1.5統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據采用SSPS11.0軟件進行配對t檢驗統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1兩組大鼠聲刺激強度為90 dB時ABR波Ⅰ、Ⅲ潛伏期及反應閾見表1。

2.2鼓室導抗圖測試結果 實驗組ABR反應閾高于對照組(P<0.05)，波I、III潛伏期較對照組長(P<0.05)，I-III波間期兩組無顯著差異。對照組大鼠麻醉狀態(tài)下均為A型或As型圖(本文統(tǒng)稱為有峰型)，對照組大鼠聲導納值、峰壓值、耳道容積及梯度值分別為0.57±0.09 ml、-21.00±24.24 daPa、0.42±0.07 ml和273.71±31.19 daPa，峰壓值在-50～+50之間的占95%(表2)。實驗組24耳中20耳鼓室導抗圖為平坦型(B型圖)(16耳于14 d時測得，3耳于21 d時測得，1耳于30 d時測得)，2耳60 d時仍為有峰型圖，判為造模不成功，1耳為化膿性中耳炎，1耳為化膿性乳突炎，無動物死亡，造模成功率為83.3%(20/24)。

表1 兩組大鼠ABR反應閾(dB SPL)及90 dB SPL聲刺激時波Ⅰ、Ⅲ潛伏期、Ⅰ-Ⅲ波間期(ms)比較

注：*與對照組比較，P<0.05

表2 正常大鼠鼓室峰壓值分布范圍

2.3光鏡下見對照組咽鼓管黏膜細胞核排列整齊，皮下為致密纖維結締組織，血管甚少，緊貼于軟骨表面，無炎性細胞(圖2)；而實驗組咽鼓管黏膜上皮層次增多，炎性細胞浸潤明顯，黏膜下毛細血管擴張充血，明顯增生(圖3)。對照組中耳黏膜下層有少許纖維母細胞和少許膠原纖維以及中性多形核白細胞、淋巴細胞，纖毛排列整齊(圖4)；實驗組中耳腔黏膜出現(xiàn)成纖維細胞增生，新生血管增多，單核巨噬細胞浸潤，中耳黏膜明顯增厚，纖毛倒伏、缺失(圖5、6)。

3 討論

OME發(fā)病機制復雜，普遍認為可能與咽鼓管通氣功能不良、細菌病毒感染及免疫功能紊亂相關[6]。目前構建OME動物模型的方法有：①經鼓膜直接注射卵蛋白、肺炎鏈球菌血清、有莢膜或無莢膜細菌、死菌或脂多糖等，通過誘發(fā)感染及變態(tài)反應途徑導致中耳腔產生積液，但此法可造成鼓膜完整性的破壞，易引起術后注射部位愈合不良、局部反應較重、中耳腔感染播散等，而導致造模成功率下降[1]。②破壞咽鼓管的通氣功能。常用兩種方法：一是阻塞咽鼓管咽口，如用化學制劑或電灼致咽鼓管口疤痕粘連而阻塞，或者用彈性材料封堵咽鼓管咽口；二是破壞咽鼓管的開放功能，如手術切斷顎帆

圖1 手術圖示 圖2 對照組咽鼓管黏膜(HE×400) 圖3 模型組咽鼓管黏膜(HE×400)

圖4 對照組中耳腔黏膜(HE×400) 圖5 模型組中耳腔黏膜(HE×400) 圖6 模型組中耳腔黏膜(HE×400)

張肌和翼突鉤，或切斷支配它的三叉神經分支等。該方法手術創(chuàng)傷較大，操作困難，動物會因術中、術后窒息或因疼痛影響動物進食、術后急性肺水腫等死亡，故死亡率較高[7]。但若造模成功，中耳腔積液的產生率很高(80%)[2]。經腭徑路和經下頜徑路都是通過阻塞咽鼓管導致中耳積液而形成分泌性中耳炎，可以避免因化學及生物學因素導致的損傷。經頜下徑路雖因打開了聽泡有導致化膿性中耳炎的可能，但手術過程中如注意無菌操作，術后常規(guī)應用抗生素預防感染，可以降低化膿性中耳炎的發(fā)生率。且經頜下徑路可避免術后疼痛影響動物進食、術中誤吸血液而導致窒息的可能。本組24只大鼠(24耳)，采用頜下徑路阻塞咽鼓管的方法建立OME模型，動物無術中死亡，術后至少可以存活60 d。

本文結果可見，正常大鼠鼓室導抗圖的峰壓值為-21±24.24 daPa，在-50～+50之間的占95%，表明其咽鼓管功能良好。而實驗組20耳鼓室導抗圖為B型，說明木塞阻塞咽鼓管后，咽鼓管功能發(fā)生障礙，導致了中耳腔負壓，最終導致中耳積液的產生。從兩組的ABR反應閾來看，實驗組手術后ABR反應閾明顯提高，波Ⅰ、Ⅲ潛伏期顯著延長，Ⅰ-Ⅲ波間期無明顯變化，說明其聽力下降主要為傳導性聾，即鼓室積液導致鼓膜及圓窗膜振動受限所致[8]。說明OME模型成功建立。

從中耳粘膜的光鏡下所見看，實驗組大鼠咽鼓管上皮層次增多，小血管明顯充血，鼓室黏膜上皮細胞明顯增生，炎性細胞浸潤明顯，黏膜下毛細血管擴張充血，明顯增生；術后四周出現(xiàn)成纖維細胞增生，新生血管增多，單核巨噬細胞浸潤，中耳黏膜明顯增厚，因此，組織學上也證實OME動物模型造成模成功。造模成功率為83.3%。

綜上所述，通過頜下徑路阻塞咽鼓管的方法可以影響咽鼓管的功能，從而能成功建立OME動物模型。

(致謝 ：本文在實驗期間得到了上海交通大學耳鼻咽喉科學研究所殷善開教授、王堅教授、黃艷艷老師的熱心指導，在此表示感謝！)

4 參考文獻

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7 Zhang Q, Liu C, Gao X,et al. Expression pattern of aquaporin 1 in the middle ear of the guinea pig with secretory otitis media [J]. ORL J Otorhinolaryngol，2009，71:70.

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