聲刺激誘發(fā)麻醉豚鼠前庭咬肌反射及起源的研究

孫偉 孔維佳 范國潤

在一些低等的脊椎動物例如魚類，三個半規(guī)管及橢圓囊是平衡器官，球囊是聽覺器官，在高等脊椎動物及哺乳動物,雖然耳蝸已經(jīng)代替球囊成為主要的聽覺器官，但有證據(jù)表明哺乳動物的球囊仍保留對聲音刺激的敏感性[1，2]。最近，聲刺激人類前庭球囊誘發(fā)的頸部胸鎖乳突肌反射，已被臨床用作檢測前庭球囊功能的方法，稱為前庭誘發(fā)的肌源性電位(vestibular evoked myogenic potential,VEMP)。VEMP在上半規(guī)管裂綜合征、梅尼埃病、前庭神經(jīng)炎、聽神經(jīng)瘤等疾病的診斷中已得到廣泛應(yīng)用[3～6]。但由于VEMP檢測需要胸鎖乳突肌保持一定的張力，一些老年人及頸椎病患者很難或不能進行VEMP檢測。為了解決這一難題，有研究者擬尋找在其它肌肉記錄前庭肌反射的方法， Deriu 等通過電及聲刺激人類前庭，在咬肌記錄到肌源性電位，并說明該電位起源于前庭及可能存在前庭-三叉神經(jīng)反射[7，8]。然而，對聲刺激誘發(fā)的咬肌反射仍然沒有一個理想的動物模型。因此，為了建立前庭咬肌反射的動物模型，本研究擬觀察在麻醉下豚鼠咬肌能否記錄到click聲誘發(fā)的電位，并通過切斷前庭下神經(jīng)及破壞耳蝸神經(jīng)，證實該電位的起源。

1 資料與方法

1.1實驗動物與分組 20只健康豚鼠(國際無品系、普通級、雌雄各半，來源于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部)，體重250～350 g。無步態(tài)不穩(wěn)、平衡障礙等行為異常，耳廓反射靈敏。動物被隨機分為正常對照組(n=10)、前庭下神經(jīng)切斷組(n=5)、耳蝸神經(jīng)切斷組(n=5)。

1.2click誘發(fā)的咬肌反射電位及ABR檢測

1.2.1click誘發(fā)的咬肌反射電位檢測 在10%水合氯醛腹腔注射麻醉下(2.5 ml/kg)，將針式記錄電極插入豚鼠右側(cè)咬肌下1/3表層，參考電極插入鼻尖，接地電極插入頭頂部皮下。在豚鼠的下頜骨下緣及顱頂之間用一個金屬夾夾住，使豚鼠咬肌保持一定的張力，用Smart EP誘發(fā)電位儀(美國智聽公司)記錄咬肌電位。0.1 ms click聲由插入外耳道內(nèi)的ER3A耳機(型號MO15300,美國智聽公司)產(chǎn)生，肌電圖信號放大100 k，帶通濾波30～3 000 Hz,刺激重復(fù)率5 Hz,掃描時間24 ms,疊加200次。刺激強度從100 dB nHL開始，每次下降10 dB,直到波形消失，以波Ⅲ確定閾值。在閾值強度連續(xù)進行3次記錄，以驗證其重復(fù)性。

1.2.2ABR檢測 在10%水合氯醛腹腔注射麻醉下(2.5 ml/kg)，針式記錄電極插入豚鼠右耳后皮下，參考電極插入左耳后皮下，接地電極插入頭頂部皮下。用Smart EP誘發(fā)電位儀(美國智聽公司)記錄ABR，0.1 ms click聲作為刺激聲，帶通濾波100～3 000 Hz,疊加次數(shù)1 024次，掃描時間24 ms,刺激重復(fù)率20次/秒,信號放大100 k, 刺激強度從100 dB nHL開始，每次下降10 dB,直到波形消失，以波Ⅲ確定閾值。

1.3前庭下神經(jīng)切斷及耳蝸神經(jīng)破壞

1.3.1前庭下神經(jīng)切斷 10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3.0 ml/kg)，將豚鼠置于37℃的熱水袋上，術(shù)區(qū)備皮，消毒。在右耳作耳后切口，在背泡后上方，相當(dāng)于弓狀下窩的位置，用電鉆開一個0.8 cm×0.8 cm的骨窗，暴露小腦旁絨球，并將其推向小腦側(cè)，暴露出弓狀下窩的內(nèi)側(cè)緣，在硬腦膜外沿內(nèi)側(cè)緣向下分離，可見前上及后下2個神經(jīng)束，后下神經(jīng)束的背側(cè)為前庭下神經(jīng)，將其切斷，縫合切口。

1.3.2耳蝸神經(jīng)破壞 10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3.0 ml/kg)，將豚鼠置于37℃的熱水袋上，術(shù)區(qū)備皮，消毒。在右耳作耳后切口，暴露聽泡，在其后方開一個0.5 cm×0.5 cm的窗口，顯露圓窗龕及耳蝸底回，在耳蝸底回的圓窗龕下方0.2 cm開窗，暴露蝸軸，用尖鉤針破壞蝸軸，并將其內(nèi)的蝸神經(jīng)離斷。取切口周圍少許肌肉填充到耳蝸底回開窗處，防止淋巴液外溢，縫合切口。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。不同刺激強度潛伏期之間的比較用單因素方差分析。對照組與手術(shù)組之間相同刺激強度潛伏期的比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1正常對照組、前庭下神經(jīng)切斷組及耳蝸神經(jīng)破壞組術(shù)前100、90、80、70 dB nHL右側(cè)聲刺激，同側(cè)記錄咬肌反射電位的負波(negative peak,NP)引出率及潛伏期見表1。不同刺激強度咬肌反射NP潛伏期無明顯差異(P>0.05)。三組NP平均閾值為92±7.68 dB nHL，ABR的平均反應(yīng)閾為31±7.88 dB nHL。圖1顯示同一只豚鼠，在下頜骨下緣與顱頂之間未用金屬夾咬肌松弛時，聲誘發(fā)咬肌反射NP消失，應(yīng)用金屬夾咬肌緊張后，NP存在。ABR正常。

2.2單側(cè)前庭下神經(jīng)切斷組術(shù)后，右耳咬肌反射均消失，ABR存在，其平均反應(yīng)閾為33±8.37 dB nHL，且與正常對照組無差異(P>0.05)。圖2顯示同一只豚鼠切斷前庭下神經(jīng)后，聲誘發(fā)咬肌反射NP消失，ABR正常。

表1 正常對照組及手術(shù)組術(shù)前右側(cè)聲刺激同側(cè)記錄NP的引出率及潛伏期

圖1 正常對照組100 dB nHL click聲刺激右側(cè)咬肌反射及ABR波形

圖2 前庭下神經(jīng)切斷組100 dB nHL click聲刺激右側(cè)咬肌反射及ABR波形

圖3 耳蝸神經(jīng)切斷組100 dB nHL click聲刺激右側(cè)咬肌反射及ABR波形

2.3單側(cè)耳蝸神經(jīng)破壞組術(shù)后，右耳在100、90、80 dB nHL不同聲刺激強度下，同側(cè)記錄的咬肌反射NP潛伏期分別為6.58±0.20、6.63±0.18、6.68±0.14 ms。NP平均閾值為96±5.48 dB nHL。NP閾值、潛伏期與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；右耳ABR均消失。圖3顯示同一只豚鼠破壞耳蝸神經(jīng)后，聲誘發(fā)咬肌反射NP存在，ABR消失。

3 討論

Tolu報導(dǎo)電刺激麻醉豚鼠前庭可以影響咬肌的活動，說明可能存在前庭三叉神經(jīng)反射，而且在前庭及三叉神經(jīng)系統(tǒng)之間可能存在多突觸通路[9]。Satoh報導(dǎo)電刺激大鼠的前庭神經(jīng)內(nèi)側(cè)核及下核，能夠調(diào)節(jié)咬肌的單突觸反射[10]。Deriu 對一個左側(cè)急性前庭功能障礙而雙側(cè)聽力正常的患者檢測聲誘發(fā)的咬肌反射，結(jié)果左側(cè)咬肌反射消失，右側(cè)正常，說明聲刺激誘發(fā)的咬肌反射來源于前庭[11]。

Giaconi 將跨突觸的逆行示蹤劑注射到大鼠咬肌表層下三分之一多個部位，標(biāo)記物先后出現(xiàn)在同側(cè)的三叉神經(jīng)運動核及雙側(cè)的前庭神經(jīng)核，集中聚集在前庭神經(jīng)內(nèi)側(cè)核的尾部。說明前庭神經(jīng)核可直接投射到支配咬肌表層下三分之一的運動神經(jīng)元，前庭神經(jīng)內(nèi)側(cè)核可能在前庭三叉神經(jīng)反射中起重要作用[12]。最近，又證實前庭神經(jīng)內(nèi)側(cè)核及咬肌運動神經(jīng)元之間有單突觸的通路存在[13]。

本研究在動物麻醉的情況下，在豚鼠的下頜骨及顱頂之間用金屬夾夾住，使咬肌呈緊張狀，從而記錄到肌源性電位，減少了清醒狀態(tài)下腦電活動、頭部及四肢運動對該電位的影響；切斷前庭下神經(jīng)后，可見聲誘發(fā)的咬肌反射消失，耳蝸神經(jīng)破壞后，咬肌反射存在，說明該反射起源于前庭，而不是耳蝸；在咬肌松弛的情況下，該反射消失，咬肌緊張時，該反射存在，說明該反射為肌源性。

人類在胸鎖乳突肌上記錄到的前庭誘發(fā)肌源性電位的振幅與胸鎖乳突肌張力的大小呈正相關(guān)[14]。本研究中，應(yīng)用金屬夾的目的是使咬肌緊張，研究中所有動物應(yīng)用同一個金屬夾，且本研究所應(yīng)用的豚鼠其下頜骨與顱頂之間的距離差距很小，所以夾子力量的大小基本上是一致的。

本實驗中手術(shù)切斷前庭下神經(jīng)后動物的ABR反應(yīng)閾與正常對照組無差異，表明耳蝸神經(jīng)功能完好；手術(shù)破壞耳蝸神經(jīng)后，動物的ABR消失，說明耳蝸神經(jīng)被完全破壞，此時聲誘發(fā)的前庭咬肌反射NP波的潛伏期與正常對照組無差異,說明在破壞耳蝸神經(jīng)的過程中，前庭感受器沒有受到影響。

根據(jù)電生理及免疫組織化學(xué)的結(jié)果，聲誘發(fā)的前庭咬肌反射可能的反射通路為球囊-前庭下神經(jīng)-前庭神經(jīng)內(nèi)側(cè)核-三叉神經(jīng)運動核-咬肌運動神經(jīng)元—咬肌。聲誘發(fā)的前庭咬肌反射的功能，可能是通過興奮或抑制咬肌來調(diào)節(jié)頭部突然的向上和向下運動[8]，另一方面，前庭對咬肌的影響可能是在運動中維持下頜的位置[15]。

本研究通過手術(shù)破壞前庭下神經(jīng)及耳蝸神經(jīng)的方法，證實click聲誘發(fā)的咬肌肌源性電位起源于前庭；成功建立了click聲誘發(fā)的咬肌肌源性電位的動物模型。通過前庭咬肌反射可了解球囊斑及反射通路的功能狀態(tài)，為研究不同的前庭疾病，例如膜迷路積水、前庭神經(jīng)炎等提供了新的研究方法。

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