高效液相色譜法測(cè)定利塞膦酸鈉的含量

萬維香，瞿建江

（江蘇省泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300）

高效液相色譜法測(cè)定利塞膦酸鈉的含量

萬維香，瞿建江

（江蘇省泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300）

目的建立測(cè)定利塞膦酸鈉含量的高效液相色譜法。方法色譜柱為漢邦C18柱（250 mm×4.6 mm,5!m），流動(dòng)相為緩沖液（含5 mmol/L磷酸二氫銨、2 mmol/L四丁基溴化銨、1.5 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.2）－甲醇（75∶25，v/v），流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)262 nm。結(jié)果輔料及中間體對(duì)樣品測(cè)定不產(chǎn)生干擾，利塞膦酸鈉質(zhì)量濃度在4.2～37.8!g/mL范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系，平均回收率為100.5%，RSD為1.1%（n=9）。結(jié)論該法可以用于利塞膦酸鈉的含量測(cè)定。

利塞膦酸鈉；含量；高效液相色譜法

利塞膦酸鈉(sodium risedronate)用于治療骨質(zhì)疏松，可有效抑制骨吸收、改善骨質(zhì)結(jié)構(gòu)，效果良好[1]。與其他雙膦酸鹽類藥物相比，利塞膦酸鈉具有高效、安全、服用劑量小等優(yōu)點(diǎn)，有著良好的發(fā)展前景[2]。其常用的含量測(cè)定方法是采用有機(jī)破壞后比色法測(cè)定分子中磷的含量，再換算成利塞膦酸鈉的含量。筆者采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定了其含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（美國(guó)），包括Waters1525泵、Waters2487檢測(cè)器、漢邦HB230A柱溫箱；Breeze色譜工作站。利塞膦酸鈉對(duì)照品（純度為86.3%，批號(hào)為 20080321）及樣品（批號(hào)為 20060601，20060602，20060603），均自制品；水為重蒸水（自制）；甲醇為色譜純（漢邦科技有限公司，批號(hào)為200605072），磷酸二氫銨，乙二胺四乙酸二鈉，四丁基溴化銨，氫氧化鈉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：漢邦 C18柱（250 mm×4.6 mm，5!m）；流動(dòng)相：緩沖液（含5 mmol/L磷酸二氫銨、2 mmol/L四丁基溴化銨、1.5 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉、用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.2）－甲醇（75∶25，v/v）；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：262 nm；進(jìn)樣量：20!L。在此條件下，色譜圖見圖1。理論塔板數(shù)按利塞膦酸鈉峰計(jì)算不低于4 000。

2.2 溶液制備

取利塞膦酸鈉對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成每1 mL含利塞膦酸鈉20!g的溶液，即得對(duì)照品溶液。取利塞膦酸鈉樣品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成每1 mL含利塞膦酸鈉20!g的溶液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

空白干擾試驗(yàn)：分別精密吸取2.2項(xiàng)下溶液及空白輔料溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖（圖1）。結(jié)果表明溶劑及空白輔料溶液對(duì)利塞膦酸鈉含量測(cè)定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密稱取利塞膦酸鈉對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解，制成質(zhì)量濃度分別為 4.2，12.6，21.0，29.4，37.8!g/mL 的對(duì)照品溶液。精密吸取上述溶液各20!L，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積。以峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A=11 019C －4 048.8，r=1.000 0（n=5）。結(jié)果表明利塞膦酸鈉質(zhì)量濃度在4.2～37.8!g/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

回收率試驗(yàn)：分別按已知樣品含量75%，100%，125%的量，加入利塞膦酸鈉對(duì)照品和處方配比的輔料于量瓶中，依法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，分別于 1，2，3，5，10，20，30 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果峰面積的 RSD為1.1%（n=7），表明供試品溶液在30 h內(nèi)穩(wěn)定。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：對(duì)同一批（批號(hào)為20060601）樣品6份，依法測(cè)定。結(jié)果峰面積的 RSD為0.3%（n=6），表明方法重現(xiàn)性好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，計(jì)算進(jìn)樣精密度，結(jié)果的 RSD為1.0%。以不同試驗(yàn)人、不同儀器對(duì)同一對(duì)照品及同一批（批號(hào)為20060601）樣品6份進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果的 RSD均小于2%，表明中間精密度良好。

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依法測(cè)定含量，并與藥典中紫外分光光度法（UV法）[3]測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果見表2?？梢姡@兩種方法均可準(zhǔn)確測(cè)定本品的含量，準(zhǔn)確度良好。由于HPLC法準(zhǔn)確度更高，因此最終采用其作為本品的含量測(cè)定方法。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

取利塞膦酸鈉對(duì)照品適量，溶于流動(dòng)相中,在紫外可見分光光度計(jì)上于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描,結(jié)果在262 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。

利塞膦酸鈉分子結(jié)構(gòu)中含有的親水基團(tuán)較多，疏水基團(tuán)較少,這就使得其在反相固定相上保留較弱、出峰較快；另外，由于兩個(gè)磷酸根基團(tuán)在水溶液中均可發(fā)生解離，因此在流動(dòng)相中利塞膦酸鈉實(shí)際上是以游離態(tài)和解離態(tài)多種形式存在，這是造成利塞膦酸鈉色譜峰形拖尾的原因之一。

由于利塞膦酸鈉在流動(dòng)相中主要以陰離子的形式存在，因此采用與呈陽離子的離子對(duì)試劑形成離子對(duì)的方法，可以延長(zhǎng)利塞膦酸鈉的出峰時(shí)間。參考文獻(xiàn)[1]選用溴化銨類試劑。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)色譜系統(tǒng)的其他條件一定時(shí)，利塞膦酸鈉的保留時(shí)間與離子對(duì)試劑的烴基鏈長(zhǎng)呈正相關(guān),即四乙基溴化銨對(duì)出峰時(shí)間的影響最小,四丁基溴化銨的影響適中,而十八烷基三甲基溴化銨的影響最大，最終選擇四丁基溴化銨作為色譜系統(tǒng)的離子對(duì)試劑。

文獻(xiàn)[3]中曾采用聚合物固定相、將流動(dòng)相pH調(diào)至11～12來改善雙膦酸鹽類藥物的色譜峰形。本試驗(yàn)考察了反相色譜柱在其耐受的pH范圍(即pH 2～8)條件下，利塞膦酸鈉色譜峰形與流動(dòng)相pH之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相pH的提高對(duì)色譜峰形的改善作用并不明顯。利塞膦酸鈉與金屬離子有較強(qiáng)的絡(luò)合作用[4－5]。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向流動(dòng)相中加入少量絡(luò)合劑乙二胺四乙酸二鈉時(shí),色譜峰形可得到明顯改善。這可能與乙二胺四乙酸二鈉能減弱固定相上痕量金屬離子與利塞膦酸鈉的絡(luò)合作用有關(guān)。

[1]郝衛(wèi)強(qiáng),劉文英，狄 斌，等.高效液相色譜法測(cè)定利塞膦酸鈉片的含量[J]. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，32（4）：286 －289.

[2]Sir is ES,Chines AA,Altman RD,et al.Risedronate in the treatment of Paget′s disease of bone：an open label,m9lticenter st9dy[J].J B one Miner Res,1998,13(6)：1 032 － 1 038.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005：附錄191－193.

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Determination of Sodium Risedronate by HPLC

Wan Weixiang,Qu Jianjiang
（Taizhou Municipal People's Hospital,Taizhou,Jiangsu,China 225300）

ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of sodium risedronate.MethodsThe analysis was achieved by using Hanbang C18column with the buffer solution－ methanol(75∶25,v/v)as the mobile phase.The buffer solution was prepared by dissolving 5 mmol/L ammonium dihydrogen phosphate,2 mmol/L tetrabutyl ammonium bromide,1.5 mmol/L disodium ethylenediamine tetraacetic acid and adjusted to pH=7.2 with sodium hydroxide.The detection wavelength was at 262 nm,the velocity was 1 mL/min.ResultsThe sample was not interfered with materials and intermediates.The linear range was 4.2－37.8!g/mL(r=1.000 0).The average recovery rate was 100.5%,RSD=1.1%(n=9).ConclusionThis method can be used to assay the sodium risedronate.

sodium risedronate;content;HPLC

R927.2；R982

A

1006－4931(2010)04－0024－02

2009－09－02)