重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合紫杉醇對裸鼠MKN-45胃癌抗腫瘤效應(yīng)的實驗研究

錢 飛， 馬利林， 朱建偉， 于嘉偉， 袁 健

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居人類惡性腫瘤的第2位[1]。目前國內(nèi)外應(yīng)用較多的胃癌化療方案是兩藥以上的聯(lián)合化療，以期減少耐藥株的出現(xiàn)，獲取較好療效。但目前尚無一種化療方案能在完全緩解率、中位生存期等方面達(dá)到令人滿意的效果[2]。因此，胃癌化療至今尚無標(biāo)準(zhǔn)可循。胃癌作為血管依賴性的實體瘤，新生血管在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能具有非常關(guān)鍵的作用，抗血管生成治療正逐步成為腫瘤治療領(lǐng)域中的熱點之一。本實驗采用胃癌MKN-45細(xì)胞株作裸鼠原位移植，建立類似于臨床胃癌生長、轉(zhuǎn)移的裸鼠模型，觀察抗血管生成代表藥物重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合細(xì)胞毒化療藥物紫杉醇對裸鼠胃癌原位移植瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響，探討重組人血管內(nèi)皮抑素是否增強化療藥物的療效或兩藥聯(lián)合是否具有明顯的協(xié)同作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 將人胃癌MKN-45細(xì)胞株(購自中科院上海細(xì)胞庫)置于10%胎牛血清, RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，每5～7天傳代1次。

1.1.2 藥物及試劑 重組人血管內(nèi)皮抑素(江蘇先聲藥業(yè)，批準(zhǔn)文號: 國藥準(zhǔn)字S20050088)。紫杉醇(華北制藥集團(tuán)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20084439)。原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(In Situ Apoptosis Drtection KitI)，CD34(H-140)，多克隆抗體(SC-9095)，VEGF ELISA試劑盒和bFGF ELISA試劑盒(武漢博士德公司)。

1.1.3 實驗動物 SPF級裸鼠，BALB/c-nu/nu，38只，揚州大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：[蘇]SCXK 2007-0001，南通大學(xué)動物中心飼養(yǎng)，雌雄各半，鼠齡6～8周，體重18～20 g。

1.1.4 動物模型 將人胃癌細(xì)胞株MKN- 45配成濃度為5×107個/mL混懸液0.2 mL，注入小鼠腋窩下。成瘤后鼠間傳代成實體瘤，本組實驗取第5代瘤源。原位動物模型的建立：裸鼠術(shù)前禁食12 h，腹腔注射50 mg/kg氯胺酮麻醉，常規(guī)消毒皮膚，沿左腹正中旁線切開約1.5 cm，打開腹腔后將胃拉出，取第五代裸鼠皮下移植瘤切成直徑1 mm的瘤塊，無菌針頭輕微損傷(以出血為度)胃大彎中部漿肌層，將1塊瘤組織用醫(yī)用OB膠粘合在破損處。10 s 凝固后將胃壁回納入腹腔，逐層關(guān)腹，完成造模工作。

1.1.5 實驗分組給藥 接種3周后，從體表觸摸已有腫瘤形成，開始用藥。32只裸鼠隨機分為4組，每組8只，分別為對照組、重組人血管內(nèi)皮抑素組(簡稱抑素組，下同)、單一化療組和聯(lián)合用藥組。抑素組選用重組人血管內(nèi)皮抑素，劑量為15 mg/kg，尾靜脈注射，自第1天起連續(xù)用藥14天；單一化療組選用紫杉醇，劑量為20 mg/kg，第1、7、14天行腹腔注射，連續(xù)用藥2周后停用1周，共3個療程；聯(lián)合用藥組兩藥聯(lián)合應(yīng)用，劑量用法均同單藥組；對照組注射相同體積的生理鹽水。

1.2 檢測指標(biāo)與方法

1.2.1 腫瘤生長情況 實驗第9周將裸鼠脫頸處死，原位腫瘤直接稱重，并根據(jù)以下公式計算各組藥物的抑瘤率：抑瘤率=(對照組瘤重-治療組瘤重)/對照組瘤重×100%。

1.2.2 腫瘤轉(zhuǎn)移情況 通過大體觀察和HE切片觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，任何臟器或組織有轉(zhuǎn)移灶或癌性腹水即被認(rèn)定為有轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移率=(有轉(zhuǎn)移動物數(shù)/該組動物總數(shù))×100%。

1.2.3 癌細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI) 采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL法)檢測細(xì)胞凋亡，計算凋亡指數(shù)時僅以癌細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞，每例切片5個隨機400倍視野中的凋亡細(xì)胞平均數(shù)即為其凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/癌細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.4 腫瘤微血管密度(MVD) 采用CD34抗體檢測，具體操作步驟按說明書進(jìn)行，DAB顯色，MVD的計算參照按Weidner[3]報道的方法，以任何1個棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞叢作為1個血管。先在低倍鏡下觀察切片全部視野，找到腫瘤血管密度最高區(qū)域，然后在高倍鏡下計數(shù)5個視野的微血管數(shù)，取其平均值作為該例腫瘤的MVD。

1.2.5 血清VEGF及bFGF 分別于裸鼠用藥前1天和處死前從內(nèi)毗靜脈采血，置于干凈2 mL Eppendorf 管中，4℃冰箱中過夜，次日2000 rpm離心15 min，小心吸取上清液，雙抗體夾心ELISA法檢測血清中VEGF及bFGF濃度，具體操作步驟按說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較均采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 重組人血管內(nèi)皮抑素與紫杉醇對裸鼠一般狀況的影響

整個實驗過程中，32只實驗動物均未出現(xiàn)明顯精神不振、活動減少、食量下降、消瘦、血便、腹瀉等癥狀，生存良好，無1例死亡。測量各組裸鼠體重，用藥前后各組差異均無顯著性,體重變化差異亦無顯著性(P>0.05) (見表1)。

表1 用藥前后裸鼠的體重

各組間比較，P>0.05

2.2 腫瘤轉(zhuǎn)移情況

通過大體觀察和HE切片觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移情

況，任何1個臟器或組織有轉(zhuǎn)移灶或出現(xiàn)癌性腹水即被認(rèn)定為有轉(zhuǎn)移(見表2)。

轉(zhuǎn)移率=(有轉(zhuǎn)移動物數(shù)/該組動物總數(shù))×100%

表2 重組人血管內(nèi)皮抑素和紫杉醇對原位移植人胃癌轉(zhuǎn)移的影響

*P<0.01，**P<0.05(與對照組比較)；*P<0.05，**P<0.01(與聯(lián)合用藥組比較)

2.3 各組小鼠瘤重變化

抑素組、單一化療組和聯(lián)合用藥組的抑瘤率與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合用藥組比兩藥單獨應(yīng)用時抑瘤率更加顯著(P<0.01或P<0.05)(見表3)。

表3 重組人血管內(nèi)皮抑素和紫杉醇對原位移植人胃癌生長的抑制作用

抑瘤率：*P、**P<0.01(與對照組比較)；*P<0.01、**P<0.05(與聯(lián)合用藥組比較)；

凋亡指數(shù)：*P<0.05，*#P<0.01(與對照組比較)；*P<0.01，*#P<0.05(與聯(lián)合用藥組比較)；MVD：*P<0.05，*△P<0.01(與對照組比較)；*P<0.01，*△P<0.05(與聯(lián)合用藥組比較)

2.4 凋亡指數(shù)(AI)

光鏡下以TUNEL法計算凋亡指數(shù)，染色陽性信號呈棕黃色，位于細(xì)胞核內(nèi)，濃縮的核質(zhì)緊貼核膜，或出現(xiàn)均勻的染色。聯(lián)合用藥組凋亡指數(shù)高于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，說明重組人血管內(nèi)皮抑素和紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用可以協(xié)同增加胃癌細(xì)胞凋亡率(見表3)。

2.5 腫瘤微血管密度(MVD)

微血管密度CD34蛋白陽性染色呈棕黃色，位于微血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，與周邊組織界限清楚，聯(lián)合用藥組微血管密度明顯低于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)(見表3，圖1～4)。

圖1 對照組MVD(400×)

圖2 抑素組MVD(400×)

圖3 單一化療組MVD(400×)

圖4 聯(lián)合用藥組MVD(400×)

2.6 血清VEGF及bFGF

采用ELISA法檢測血清VEGF和bFGF的表達(dá)，顯示抑素組血清VEGF和bFGF表達(dá)較對照組明顯降低，聯(lián)合用藥組比對照組顯著下降。(見表4，5)

表4 重組人血管內(nèi)皮抑素和紫杉醇對原位移植人胃癌VEGF表達(dá)的影響

*P<0.05，**P<0.01(與對照組比較)；**P<0.05，*P<0.01(與聯(lián)合用藥組比較)

表5 重組人血管內(nèi)皮抑素和紫杉醇對原位移植人胃癌bFGF表達(dá)的影響

*P<0.05，**P<0.01(與對照組比較)；**P<0.05，*P<0.01(與聯(lián)合用藥組比較)

3 討論

胃癌的外科治療近十年來雖然進(jìn)步很快，但治療效果卻沒有根本性的突破[4]。統(tǒng)計學(xué)資料顯示，手術(shù)前后的新輔助化療與輔助化療可以明顯提高療效，但因毒副反應(yīng)較大，患者往往不能耐受，總體有效率仍然不能令人滿意[5]。紫杉類的化療藥物是目前公認(rèn)的較為有效的化療用藥，但其對提高胃癌治療完全緩解率的作用仍然有限。因此，尋找具有低毒高效的多藥聯(lián)合治療方案具有十分重要的意義。

Folkman[6]提出，腫瘤直徑小于2 mm時，其生長緩慢，原發(fā)腫瘤僅局部浸潤，尚未發(fā)生轉(zhuǎn)移，處于所謂“潛伏期”。只有當(dāng)腫瘤直徑大于2 mm時，微血管逐漸形成，腫瘤實體隨之迅速增大，進(jìn)而發(fā)生轉(zhuǎn)移和擴散。研究表明[7]，胃癌作為血管依賴性的實體瘤，新生血管在其病程進(jìn)展中具有十分重要的作用，因此，抗血管生成治療可能在腫瘤治療領(lǐng)域中占據(jù)重要地位。本實驗采用的抗腫瘤血管生成代表藥物重組人血管內(nèi)皮抑素是以大腸桿菌作為蛋白表達(dá)體系生產(chǎn)出來的一種血管生長抑制劑，能有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，阻斷血管生長，中斷腫瘤細(xì)胞營養(yǎng)和氧氣的供應(yīng)，最終使腫瘤細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，達(dá)到“餓死”腫瘤細(xì)胞的目的。重組人血管內(nèi)皮抑素作用機制尚不明確[8]，但已有研究表明，內(nèi)皮抑素的主要作用機理可能包括：(1)抑制金屬蛋白酶活性，阻斷其降解細(xì)胞外基質(zhì)；(2)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞停滯在G1期，阻止內(nèi)皮細(xì)胞分裂；(3)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；(4)阻止內(nèi)皮細(xì)胞的粘附移行；(5)阻止生長因子與受體結(jié)合，干擾其信號傳導(dǎo)通路。動物實驗也證明內(nèi)皮抑素對肺癌、黑色素瘤、纖維肉瘤、結(jié)腸癌、肝癌、直腸癌等均有較好療效并能使腫瘤最后達(dá)到休眠狀態(tài)[9]。盡管重組人血管內(nèi)皮抑素對腫瘤的治療顯示出良好的應(yīng)用前景，但在胃癌方面的應(yīng)用研究報道甚少。本實驗研究的目的就在于探討重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合紫杉醇是否對胃癌具有協(xié)同的抗腫瘤效應(yīng)及可能的作用機制, 可能為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

一般認(rèn)為，腫瘤實體內(nèi)微血管數(shù)量與腫瘤轉(zhuǎn)移潛能成正相關(guān)，有學(xué)者在黑色素瘤及乳腺癌的觀察中發(fā)現(xiàn)，腫瘤實體內(nèi)微血管數(shù)量增多提示預(yù)后欠佳。由此我們可以看出新生血管形成是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。從本實驗我們可以看出對照組微血管密度為40.25±5.12，而聯(lián)合用藥組微血管密度為24.38±4.03，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01，說明重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合紫杉醇能明顯抑制腫瘤新生血管的形成，顯示出較強的抗腫瘤協(xié)同作用。

腫瘤血管生成是一個多因子參與的多步驟過程，阻斷此環(huán)節(jié)中的任何一步，都將阻止腫瘤血管生成[6]?，F(xiàn)有研究表明：VEGF和bFGF是目前已知的作用最強的兩種血管生成促進(jìn)因子[10]，能增加腫瘤血管的通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的萌芽、增殖、遷移，促進(jìn)腫瘤新生血管的形成、生長和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果可以看出重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合紫杉醇能明顯下調(diào)血清VEGF和bFGF的表達(dá)，這可能是聯(lián)合用藥組能顯著抑制裸鼠胃癌轉(zhuǎn)移的機制之一。

人癌轉(zhuǎn)移瘤的原位移植模型已經(jīng)成為目前國際上普遍接受的研究人癌侵襲和轉(zhuǎn)移的重要理論基礎(chǔ)。這種模型與臨床患者的轉(zhuǎn)移特點相似，轉(zhuǎn)移率高，能較客觀地模擬胃癌患者的體內(nèi)侵襲和轉(zhuǎn)移特性[11]。本實驗成功地復(fù)制了人胃癌裸鼠原位轉(zhuǎn)移模型，所有實驗動物胃壁均有胃癌的生長，荷瘤率為100%。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特征，是大多數(shù)惡性腫瘤患者的主要死亡原因。本實驗結(jié)果顯示對照組轉(zhuǎn)移率為100%，內(nèi)皮抑素組為37.5%，單一化療組為62.5%，聯(lián)合用藥組為25%，由此可見重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合紫杉醇在抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移方面存在明顯的協(xié)同作用。

腫瘤細(xì)胞的凋亡作為一個很重要的生物學(xué)指標(biāo)常用于判斷抗腫瘤藥物的療效。本組用藥9周后的結(jié)果表明，對照組腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)為21.87±3.56，內(nèi)皮抑素組為29.12±5.83，單一化療組為36.25±3.24，聯(lián)合用藥組為45.75±3.62，提示單獨使用重組人血管內(nèi)皮抑素或化療藥物紫杉醇對促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用有限，而兩者聯(lián)合應(yīng)用較其他各組有更顯著的抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。

本研究中觀察應(yīng)用重組人血管內(nèi)皮抑素的各組實驗動物，均未發(fā)現(xiàn)特殊或明顯的毒副反應(yīng)，顯示出重組人血管內(nèi)皮抑素可能具有低毒的優(yōu)點，進(jìn)一步表明重組人血管內(nèi)皮抑素在胃癌的輔助治療或綜合治療中將會具有良好的臨床應(yīng)用前景，也將為胃癌的臨床治療方案增加一種選擇。

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