環(huán)境化學(xué)致癌物聯(lián)苯胺和六氯苯對(duì)大鼠肝線粒體酶活性的影響

吳明和，周錫昌，梅秀麗，梅啟明，2，#，郭鵬

1.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢430072

2.武漢大學(xué)園林與環(huán)衛(wèi)中心，武漢430072

3.武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢430072

1 引言（Introduction）

聯(lián)苯胺（Benzidine，學(xué)名：4,4-二氨基聯(lián)苯）是聯(lián)苯的衍生物之一，目前作為染料合成的中間體被廣泛應(yīng)用于紡織印染業(yè)中.聯(lián)苯胺可與血紅蛋白結(jié)合成高鐵血紅蛋白，使血紅蛋白與氧結(jié)合能力下降；可導(dǎo)致人體急性或慢性中毒，記憶力嚴(yán)重下降，長(zhǎng)期與該類物質(zhì)接觸可引起癌癥（International Agency for Research on Cancer, 1982）.近年來(lái)，人體因聯(lián)苯胺引起的膀胱癌、肝癌、腎癌和膽管癌等疾病已屢有報(bào)道（Choudhary, 1996）.

六氯苯（1,2,3,4,5,6-Hexachlorocyclohexane，學(xué)名：六氯化苯）是一種易揮發(fā)的持久性有機(jī)污染物（International Agency for Research on Cancer, 1982）.六氯苯作為農(nóng)作物的殺蟲(chóng)劑和氯化物產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物和雜質(zhì)進(jìn)入環(huán)境，并廣泛殘留于各環(huán)境介質(zhì)中.六氯苯可在人體和各種生物體內(nèi)累積（Courtney,1979;Billi de Catabbi et al., 2000），其毒性作用的主要靶器官是動(dòng)物的肝臟.六氯苯的致突變性研究發(fā)現(xiàn)，暴露六氯苯引起的卟啉癥有引起原發(fā)性肝癌的傾向（Axelson,1986）.

目前有關(guān)聯(lián)苯胺和六氯苯的毒性作用研究已取得了一些進(jìn)展（劉紅玲等，2007;戴捷和楊慧慧，2009），但其毒性作用機(jī)制研究很少深入到細(xì)胞器水平，對(duì)哺乳動(dòng)物肝臟線粒體酶活性的影響尚鮮有報(bào)道.為此，我們通過(guò)體內(nèi)染毒方式建立毒性作用動(dòng)物模型，研究了聯(lián)苯胺和六氯苯對(duì)大鼠肝線粒體抗氧化物酶及呼吸代謝和能量轉(zhuǎn)換酶——超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPx）、細(xì)胞色素C氧化酶（COX）及鈣、鎂 ATP酶（Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase）活性的影響.對(duì)聯(lián)苯胺和六氯苯在線粒體水平上的毒性作用進(jìn)行探討，將為進(jìn)一步深入研究其毒性機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 主要試劑

聯(lián)苯胺、六氯苯、鄰苯三酚、核黃素、還原型細(xì)胞色素C、K3Fe（CN）6、1-萘酚、ATP鈉鹽、甘露醇、三羥甲基氨基甲烷（Tris）均為分析純，購(gòu)自上海試劑公司產(chǎn)品.考馬斯亮藍(lán)G-250，購(gòu)自華美試劑公司，為Sigma進(jìn)口分裝.其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

2.2 大鼠的分組及處理

選用健康成年二級(jí)SD大鼠，雌雄不分，體重（260±30）g左右，隨機(jī)分成4組，分別為對(duì)照組和3個(gè)聯(lián)苯胺處理組或3個(gè)六氯苯處理組，每組10只.其中3個(gè)聯(lián)苯胺處理組按大鼠體重分別以50、100、200mg·kg-1的聯(lián)苯胺溶液（配制：先將2g聯(lián)苯胺用5mL冰醋酸充分溶解后再用50mL滅菌雙蒸水稀釋）進(jìn)行腹腔注射；3個(gè)六氯苯處理組按大鼠體重分別以 200、400、800mg·kg-1的六氯苯溶液（配制80mg·mL-1六氯苯水溶液（母液），土溫-20助溶，其含量為1.0%，注：最高濃度組大鼠的注射劑量不超過(guò)10mL·kg-1）進(jìn)行腹腔注射，每天1次，共25d.對(duì)照組注射等體積量的生理鹽水.

2.3 大鼠肝臟線粒體的提取及線粒體酶樣品液的制備

采用文獻(xiàn)方法進(jìn)行（梅啟明和朱英國(guó)，1990;梅啟明等，2004）.

2.4 酶活性測(cè)定及數(shù)據(jù)處理

2.4.1 線粒體蛋白含量測(cè)定

線粒體蛋白定量采用Lowry法測(cè)定（李如亮，1997）.

2.4.2 SOD酶活性測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定（謝衛(wèi)華等，1988），酶活性單位以U·mg（pro）-1表示.

2.4.3 GSH-Px活性測(cè)定

采用DNTB直接法測(cè)定（夏奕明和朱蓮珍，1987），酶活性單位以U·mg（pro）-1表示.

2.4.4 COX活性測(cè)定

COX酶活性測(cè)定采用分光光度法（Smith, 1955）測(cè)定.測(cè)定的酶樣品中加入10mmol·L-1pH 7.0磷酸鉀緩沖液1.5mL、酶液10μL（含線粒體蛋白50μg）、加雙蒸水至2.9mL；對(duì)照含同量磷酸鉀緩沖液和酶液、加入 100mmol·L-1K3Fe（CN）630μL、加雙蒸水至 2.9mL；30℃溫育 5min，加入0.18mmol·L-1還原型細(xì)胞色素 C 0.1mL,直接測(cè)定還原型細(xì)胞色素C被氧化的速度（即立即記錄550nm波長(zhǎng)下光譜吸收值（A）下降的速度），計(jì)算COX活性，以一級(jí)反應(yīng)速度常數(shù)K表示酶活性，酶活性單位以K［min-1·mg（pro）-1］表示.

2.4.5 Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性測(cè)定

采用微量定磷法測(cè)定（Furui,1990）.酶活性單位以μmolPi·h-1·mg（pro）-1表示.

3 結(jié)果與分析（Results and analysis）

3.1 聯(lián)苯胺對(duì)SOD、GSH-Px、COX、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性的影響

SOD、GSH-Px、COX、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 聯(lián)苯胺對(duì)大鼠肝臟線粒體酶活性的影響Table 1 Effect of benzidine on enzyme activity of rat liver mitochonria

表1顯示，在不同濃度聯(lián)苯胺作用下，大鼠臟臟線粒體中SOD、GSH-Px和Ca2+-ATPase的活性隨聯(lián)苯胺作用濃度增加，呈現(xiàn)出先上升再下降趨勢(shì)，在聯(lián)苯胺的處理濃度為50mg·kg-1時(shí)酶活性最高，其中SOD、GSH-Px、Ca2+-ATPase分別為對(duì)照組的102.0%、126.0%和123.0%.表明大鼠肝臟線粒體對(duì)聯(lián)苯胺的毒性作用存在應(yīng)激反應(yīng).聯(lián)苯胺濃度升高至200mg·kg-1時(shí)酶活性最低，其中SOD下降30.4%，GSH-Px下降27.1%，Ca2+-ATPase下降26.8%.而COX和Mg2+-ATPase的活性則是隨聯(lián)苯胺作用濃度增加一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中200mg·kg-1濃度處理組COX和Mg2+-ATPase的活性分別只有對(duì)照組的67.0%和48.8%.

3.2 六氯苯對(duì)SOD、GSH-Px、COX、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性的影響

SOD、GSH-Px、COX、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2.

表2顯示，在不同濃度六氯苯作用下，大鼠肝臟線粒體中GSH-Px、COX和Ca2+-ATPase的活性隨六氯苯作用濃度的增加，呈現(xiàn)先上升再下降趨勢(shì).COX和 Ca2+-ATPase在六氯苯處理濃度為200mg·kg-1時(shí)酶活性最高，其中COX為對(duì)照組的107.8%，Ca2+-ATPase為對(duì)照組的112.5%；GSH-Px在六氯苯處理濃度為400mg·kg-1時(shí)活性最高，其活性為對(duì)照組的122.2%.表明大鼠肝臟線粒體對(duì)六氯苯的毒性作用存在應(yīng)激反應(yīng).六氯苯濃度升高至800mg·kg-1時(shí)酶活性最低，GSH-Px、COX和Ca2+-ATPase分別僅為對(duì)照組的 94.7%、70.9%和65.5%.而SOD和Mg2+-ATPase的活性則隨著六氯苯作用濃度增加一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，至800mg·kg-1濃度處理組時(shí)，SOD和Mg2+-ATPase的活性分別只有對(duì)照組的75.5%和57.0%.

表2 六氯苯對(duì)大鼠肝臟線粒體酶活性的影響Table 2 Effect of 1,2,3,4,5,6-hexachlorocyclohexane on enzyme activity of rat liver mitochonria

4 討論（Discussion）

接觸聯(lián)苯胺的職業(yè)性膀胱癌高危人群的原癌基因AN43基因的檢出率及mRNA的定量PCR讀數(shù)均明顯高于對(duì)照組人群（秦逸秋等，1999）.抑癌基因谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶GSTs基因型的分布在上海膀胱癌患者和聯(lián)苯胺接觸人群中顯著低于一般人群（陳紀(jì)剛等，1999）.表明聯(lián)苯胺可能對(duì)某些抑癌基因的表達(dá)具有阻遏作用而產(chǎn)生細(xì)胞毒性，對(duì)某些原癌基因的表達(dá)具有誘導(dǎo)激活的作用而使細(xì)胞產(chǎn)生癌變.在本實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)苯胺導(dǎo)致大鼠肝臟線粒體COX和Mg2+-ATPase活性持續(xù)下降，而SOD、GSH-Px和Ca2+-ATPase出現(xiàn)一定應(yīng)激反應(yīng)后活性同樣持續(xù)下降.這表明聯(lián)苯胺可能經(jīng)體內(nèi)代謝活化后，直接對(duì)線粒體DNA及其轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生作用，使酶的合成受阻，活性氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物大量產(chǎn)生.COX活性的降低表明電子傳遞過(guò)程已出現(xiàn)障礙，氧自由基的形成和泄漏的增加.由于聯(lián)苯胺的毒性作用，線粒體已處于病理狀態(tài).一方面，在聯(lián)苯胺毒性作用下，肝細(xì)胞線粒體氧自由基泄漏增加，線粒體內(nèi)單價(jià)氧大量產(chǎn)生；另一方面，由于線粒體內(nèi)單價(jià)氧大量產(chǎn)生，各類脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物大量增加，使SOD、GSH-Px過(guò)量消耗.脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的大量增加導(dǎo)致Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性降低.線粒體膜鈣泵、鎂泵（Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase）活性減弱直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，也是導(dǎo)致線粒體膜電位降低、線粒體氧化磷酸化障礙，造成線粒體膜結(jié)構(gòu)受損和細(xì)胞壞死的重要原因（Zydowo et al.,1985;Elimadi et al., 1997）.

動(dòng)物的肝臟是六氯苯毒性作用的主要靶器官，六氯苯通過(guò)影響肝臟的血紅素和膜磷脂代謝而引起卟啉血癥，甚至肝癌的產(chǎn)生（Cochón et al., 1999）.六氯苯的致突變性試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，暴露六氯苯引起的卟啉癥有引起原發(fā)性肝癌的傾向（Axelson,1986）.在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)六氯苯劑量濃度升高到800mg·kg-1時(shí)，COX和ATPase活性的下降幅度最大.分析認(rèn)為，六氯苯可能經(jīng)過(guò)兩種途徑對(duì)鼠肝細(xì)胞線粒體產(chǎn)生毒性.一方面，經(jīng)體內(nèi)代謝活化及-OH-自由基與苯環(huán)反應(yīng)而大量產(chǎn)生活性氧自由基，并對(duì)線粒體DNA及其轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生作用，使大鼠肝細(xì)胞線粒體COX合成被阻遏，酶的活性減弱.另一方面，由于線粒體COX活性被阻斷和減弱而造成呼吸鏈障礙電子泄露增加，以致活性氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物大量產(chǎn)生.結(jié)果是SOD、GSH-Px等功能酶被大量消耗，線粒體內(nèi)膜被損傷，外膜鈣泵活性降低，使線粒體及細(xì)胞內(nèi)鈣鎂平衡紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和死亡.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，線粒體內(nèi)COX電子傳遞鏈的完善與否和SOD、GSH-Px的水平是決定線粒體內(nèi)單價(jià)氧自由基泄漏多寡及各類脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生的關(guān)鍵.在本實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)苯胺、六氯苯經(jīng)體內(nèi)代謝活化后，可能直接對(duì)線粒體DNA及其轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生作用，使酶的合成受阻，由于線粒體COX代謝活性被阻斷和減弱，以至呼吸鏈障礙和電子泄露增加，線粒體活性氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物大量產(chǎn)生.超過(guò)線粒體SOD清除和GSH-Px的還原能力時(shí)，線粒體膜結(jié)構(gòu)和功能受到損傷，線粒體正常的氧化磷酸化功能障礙，外膜鈣泵活性降低，線粒體及細(xì)胞內(nèi)鈣、鎂平衡紊亂.這可能是聯(lián)苯胺、六氯苯等環(huán)境化學(xué)致癌物對(duì)線粒體損傷的主要機(jī)制.結(jié)果還表明，聯(lián)苯胺、六氯苯等環(huán)境化學(xué)致癌物可能作為呼吸鏈阻礙劑，不僅影響呼吸鏈功能，而且促進(jìn)活性氧自由基大量逸出線粒體，損傷細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞惡變.

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