XIAP表達(dá)在ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化中的意義

羅 清 ，王 娜 ，陳唐勇 ，萬臘根 ，張長林 *

(1、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006；2、南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生院，江西 南昌 330006)

XIAP表達(dá)在ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化中的意義

羅 清1，2，王 娜1，2，陳唐勇1，萬臘根1，張長林1*

(1、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006；2、南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生院，江西 南昌 330006)

目的探討X染色體相關(guān)凋亡抑制蛋白在全反式維甲酸誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞分化過程中的表達(dá)意義。方法以急性早幼粒白血病細(xì)胞NB4為細(xì)胞模型，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)、瑞氏染色、蛋白質(zhì)免疫印記等方法，觀察細(xì)胞經(jīng)ATRA處理不同時間后細(xì)胞分化情況以及XIAP蛋白表達(dá)情況。結(jié)果1μmol/L的ATRA可抑制NB4細(xì)胞的生長，在用藥處理72h后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的分化，XIAP蛋白含量明顯下降。 結(jié)論 在ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化過程中，凋亡抑制蛋白XIAP表達(dá)明顯下調(diào)。

細(xì)胞分化；凋亡抑制蛋白；全反式維甲酸

急性早幼粒細(xì)胞白血病 (Acute Promyelocytic Leukemia，APL)是一種以早幼粒細(xì)胞分化受阻為主要細(xì)胞生物學(xué)特征的急性髓細(xì)胞系白血病。研究表明，95%以上APL患者存在非隨機(jī)染色體易位t(15；17)(q22;q21)，該易位使得位于17號染色體上的維甲酸受體 α(Retinoic acid receptorα，RARα)基因與位于15號染色體上的PML(Promyelocytic leukemia)基因發(fā)生融合，形成PML-RARα融合基因，并編碼相應(yīng)的融合蛋白[1]。PML-RARα融合蛋白能以“顯性負(fù) (Dominant negative)”的方式抑制野生型PML和RARα的正常功能，導(dǎo)致骨髓粒細(xì)胞分化受阻，被認(rèn)為是導(dǎo)致APL發(fā)病的主要原因[2]。分化誘導(dǎo)藥物全反式維甲酸(All trans retinoic acid，ATRA)可以活化凋亡相關(guān)信號通路[3]，促進(jìn)絲氨酸蛋白酶(Caspases)活化并對PML-RAR蛋白剪切，從而使PML-RARα蛋白降解[4]，達(dá)到治療APL的作用。但是ATRA活化Caspases的機(jī)制并不清楚。

X染色體相關(guān)的凋亡抑制蛋白 (X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是凋亡抑制蛋白家族的成員，其能抑制Caspases的活性，阻斷內(nèi)源性和外源性凋亡信號[5]。當(dāng)XIAP表達(dá)過高可以抑制細(xì)胞的凋亡，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。那么，在ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化過程中，是否可以抑制XIAP蛋白的表達(dá)，進(jìn)而活化Caspase，從而促進(jìn)PML-RARα降解。本文就ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化過程中XIAP蛋白表達(dá)情況做一分析，進(jìn)一步探討ATRA誘導(dǎo)APL分化的分子機(jī)制。

材料與方法

1 主要試劑

兔抗人多克隆XIAP抗體購自Cell Signaling公司，鼠抗人單克隆β-actin抗體購自Sigma公司，HRP-羊抗兔IgG抗體購自Santa Cruz公司。細(xì)胞瑞氏染液購自上海信然生物技術(shù)有限公司，ATRA由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌外研究所汪泱博士惠贈。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

APL細(xì)胞株NB4細(xì)胞由法國圣路易醫(yī)院Michel Lanotte博士惠贈，細(xì)胞在含10%胎牛血清(HyClone，Logan，Utah)的 1640 培養(yǎng)液(GibcoBRL)中常規(guī)培養(yǎng) (37℃，5%CO2)， 使細(xì)胞維持在 2～5×105cells/ml的最佳生長狀態(tài)。

3 細(xì)胞生長檢測

分別在1μmol/L的ATRA處理NB4細(xì)胞0、24、48、72h時收集細(xì)胞，以細(xì)胞計(jì)數(shù)儀所計(jì)數(shù)的細(xì)胞濃度乘以細(xì)胞體積，得到該時間點(diǎn)的細(xì)胞總數(shù)，并以此繪制細(xì)胞生長曲線，分析細(xì)胞生長速度的變化。

4 細(xì)胞形態(tài)觀察

收集經(jīng)ATRA處理不同時間的NB4細(xì)胞，經(jīng)甩片、晾干后，用瑞氏染料染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞分化情況。

5 蛋白免疫印跡

NB4細(xì)胞經(jīng)ATRA處理不同時間后，分別取2×106細(xì)胞，加入 100μl蛋白裂解液(100mmol/L Tris，pH 6.8，4%SDS，0.2%溴酚藍(lán)，20%甘油和 5% β-巰基乙醇)提取蛋白。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后用XIAP抗體檢測XIAP的表達(dá)。將免疫印跡結(jié)果掃描入計(jì)算機(jī)用Quantity one軟件分析灰度積分，以未經(jīng)ATRA處理XIAP β-actin為100%，分析加藥不同時間XIAP的改變。

結(jié) 果

1 ATRA抑制NB4細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)其分化

研究表明，ATRA可以抑制APL細(xì)胞NB4生長，并誘導(dǎo)其分化。我們首先檢測了ATRA對NB4細(xì)胞的生長的影響。結(jié)果顯示，1μmol/L的ATRA明顯抑制細(xì)胞生長(圖1)，從細(xì)胞形態(tài)來看，加藥48h后，細(xì)胞核開始出現(xiàn)凹陷，胞漿染色變淡，表明細(xì)胞開始分化，72h分化更加明顯(圖2)。

圖1 ATRA對NB4細(xì)胞生長的影響

圖2 1M ATRA對NB4細(xì)胞分化的影響(A:control B:24h C:48h D:72h)

2 ATRA抑制XIAP蛋白表達(dá)

研究表明，凋亡抑制蛋白XIAP在多種腫瘤(包括實(shí)體瘤和白血病)中表達(dá)高于正常細(xì)胞，下調(diào)XIAP蛋白可以抑制腫瘤細(xì)胞生長。我們檢測了ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化中，XIAP蛋白的表達(dá)情況。western blot實(shí)驗(yàn)果顯示，用藥處理48h后，XIAP蛋白含量明顯減少(圖3)。以未處理的NB4細(xì)胞中的XIAP和β-actin蛋白表達(dá)比值為100%，通過定量分析，發(fā)現(xiàn)ATRA處理細(xì)胞72h后，XIAP蛋白的含量減少為未加藥時的28%(圖3b)。以上結(jié)果表明，XIAP蛋白含量隨著ATRA誘導(dǎo)的分化而下調(diào)。

圖3 Western blot檢測ATRA對XIAP蛋白表達(dá)的影響(a：Western blot b：Quantity assay)

討 論

凋亡抑制蛋白 (Inhibitor of apoptosis protein，IAP)是一系列可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖的蛋白分子?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)該家族含有8個成員，分別是 HIAP-1、HIAP-2、XIAP、ML-IAP、Survivin、ILP-2/Ts-IAP、NAIP、BRUCEE/apollon[6]。 研究表明，在IAP家族中，XIAP可以直接調(diào)控Caspases的活性，是唯一能夠同時抑制起始階段和效應(yīng)階段的IAP[5]。XIAP，又稱 BIRC4(Baculoviral IAP repeat-containing4)，定位于 Xq25，mRNA 全長 8413 bp,編碼區(qū)位于129 bp-1622 bp之間，其編碼的蛋白相對分子量約為57 kDa，主要由3個桿狀病毒IAP重復(fù)序列BIR1-BIR3 (Baculoviral inhibitorof apoptosis repeat)和一個RING鋅指樣結(jié)構(gòu)域 (Really new gene Zinc finger domain)組成。不同的BIR結(jié)構(gòu)域可以與不同的Caspase相互作用，進(jìn)而抑制Caspases的活性[7]。例如，BIR3與Caspase-9單體形成異源二聚體,使Caspase-9保持單體結(jié)構(gòu),喪失催化活性[8]。BIR2結(jié)構(gòu)域能結(jié)合并抑制活化的Caspase-3和Caspase-7，Caspase-3和Caspase-7是作為凋亡信號通路的效應(yīng)酶,尤其是Caspase-3是細(xì)胞膜、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)3條凋亡途徑的共同的最終效應(yīng)酶，抑制了他的活性,也就抑制了細(xì)胞的凋亡[9]。此外，XIAP還有具有E3泛素連接酶活性，能夠使蛋白泛素化進(jìn)而加速蛋白質(zhì)的降解，通過促進(jìn)降解Caspase-9和Caspase-3以及內(nèi)源性的XIAP抑制劑SMAC,進(jìn)而增強(qiáng)XIAP的抗凋亡作用[10]。因此，XIAP可以作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。

研究表明，在AML中，XIAP表達(dá)明顯高于正常人中，并且其表達(dá)的高低與疾病治療和預(yù)后明確相關(guān)，例如在成人和兒童的急性髓細(xì)胞樣白血病(AML)患者中,XIAP低表達(dá)的患者的生存率明顯高于XIAP高表達(dá)的患者[11-12]。ATRA是一種廣泛用于腫瘤治療的脂類分子，可以抑制細(xì)胞生長，并促進(jìn)細(xì)胞分化，凋亡。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，在ATRA抑制細(xì)胞生長過中，XIAP蛋白明顯下降，并隨著加藥時間的增加而逐漸減少。表明XIAP可能是ATRA發(fā)揮抗腫瘤作用的一個靶點(diǎn)分子。

正常情況下，ATRA識別并與核受體RARα結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控一系列基因的表達(dá)，使得造血細(xì)胞分化成熟。但是，在APL細(xì)胞中，由于t(15；17)染色體易位，導(dǎo)致PML與RARα形成PML-RARα融合基因，其產(chǎn)生的PML-RARα融合蛋白可以通過顯性負(fù)的方式抑制RARα的功能，繼而使得細(xì)胞阻滯在早幼粒細(xì)胞階段，不能分化成熟[1]。研究表明，藥理濃度的ATRA可以促進(jìn)PML-RARα降解，使得白血病細(xì)胞分化成熟。近年來，國內(nèi)來學(xué)者非常關(guān)注ATRA誘導(dǎo)PML-RARα降解的機(jī)制。現(xiàn)在認(rèn)為，ATRA可以通過多種途徑促進(jìn)PML-RARα降解：ATRA可以上調(diào)UBE1L蛋白，后者可以使PMLRARα融合蛋白中的PML部分發(fā)生類泛素化修飾—ISG15ylation，ISG15修飾的PML-RARα可以被蛋白酶降解[13]。另外，ATRA還可以活化凋亡相關(guān)信號通路，激活一系列絲氨酸蛋白酶Caspases的活性，進(jìn)而促進(jìn)PML-RARα和RARα的剪切[4]，而XIAP可以直接調(diào)控Caspases的活性。因此ATRA下調(diào)XIAP蛋白的表達(dá)，也可能是導(dǎo)致PML-RARα降解的原因。

本研究探討了ATRA誘導(dǎo)分化過程中XIAP蛋白表達(dá)的變化情況，但是，ATRA是通過怎樣方式調(diào)控XIAP的，以及其在APL分化中的作用，還有待進(jìn)一步研究。

[1]de Thé H,Lavau C,Marchio A,et al.The PML-RAR alpha fusion mRNA generated by the t(15;17)translocation in acute promyelocytic leukemia encodes a functionally altered RAR[J].Cell,1991,66(4):675-684.

[2]Melnick A,Licht JD.Deconstructing a disease:RARalpha,its fusion partners,and their roles in the pathogenesis of acute promyelocytic leukemia[J].Blood,1999,93(10):3167-3215.

[3]Gianni M,Ponzanelli I,Mologni L,U Reichert,A Rambaldi,M Terao and E Garattini Retinoid-dependent growth inhibition,differentiation and apoptosis in acute promyelocytic leukemia cells Expression and activation of caspases[J].Cell Death and Differentiation,2000,7(5):447-460.

[4]Yao CJ,Yang CM,Chuang SE,et al.Targeting PML-RAR{alpha}and Oncogenic Signaling Pathways by Chinese Herbal Mixture Tien-Hsien Liquid in Acute Promyelocytic Leukemia NB4 Cells[J].Evid Based Complement Alternat Med,2009,Nov 23.

[5]Deveraux QL,Takahashi R,Salvesen GS,et al.X-linked IAP is a direct inhibitor of cell-death proteases[J].Nature,1997,388(6639):300-304.

[6]Nachmias B,Ashhab Y,Ben-Yehuda D.The inhibitor of apoptosis protein family(IAPs):an emerging therapeutic target in cancer[J].Semin Cancer Biol,2004,14(4):231-243.

[7]張曙光 劉芝華,張 林.凋亡抑制基因XIAP在腫瘤治療中的研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志,2006,14(26):2626-2631.

[8]Shiozaki EN,Chai J,Rigotti DJ,et al.Mechanism of XIAP-mediated inhibition of caspase-9[J].Mol Cell,2003,11(2):519-527.

[9]Scott FL,Denault JB,Riedl SJ,et al.XIAP inhibits caspase-3 and-7 using two binding sites:evolutionarily conserved mechanism of IAPs[J].EMBO J,2005,24(3):645-655.

[10]Morizane Y,Honda R,Fukami K,et al.X-linked inhibitor of apoptosis functions as ubiquitin ligase toward mature caspase-9 and cytosolic Smac/DIABLO[J].J Biochem(Tokyo),2005,137(2):125-132.

[11]Tamm I,Richter S,Oltersdorf D,et al.High expression levels of x-linked inhibitor of apoptosis protein and survivin correlate with poor overall survival in childhood de novo acute myeloid leukemia[J].Clin Cancer Res,2004,10(11):3737-3744.

[12]Tamm I,Richter S,Scholz F,et al.XIAP expression correlates with monocytic differentiation in adult de novo AML:impact on prognosis[J].Hematol J,2004,5(6):489-495.

[13]Shah SJ,Blumen S,Pitha-Rowe I,et al.UBE1L represses PML/RAR{alpha}by targeting the PML domain for ISG15ylation[J].Mol Cancer Ther,2008,7(4):905-14.

The significance of X-linked apoptosis inhibitor protein expression in acute promyelocytic leukemia cells induced by all trans retinoic acid

LOU Qing,WANG Na,CHEN Tangyong,et al.Department of Clinical Laboratory,The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006,China

ObjectiveTo explore the significance of X-linked inhibitor of apoptosis protein(XIAP)expression in the cellular differentiation of acute promyelocytic leukemia(APL)induced by all trans retinoic acid(ATRA).MethodsWith the model of APL cell line NB4,the cell count and Wright stain were applied to observe the morphologic features and the differentiation of the cells induced with ATRA,and XIAP expression was tested by western blot.ReasultsThe growth of NB4 cells was inhibited with 1μmol/L ATRA.As treated with ATRA for 72 hours,NB4 cells differentiation was obvious and XIAP expression was significantly decreased.ConclusionXIAP expression can be inhibited in the differentiation of APL cells induced ATRA.

Cell differentiation;Apoptosis inhibitor protein;All trans retinoic acid

R329.2+8,R733.7

A

1674-1129(2010)06-0546-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2010.06.005

南昌大學(xué)科技基金項(xiàng)目(編號48)，江西省衛(wèi)生廳科技項(xiàng)目(編號 20091046)，

*通訊作者：張長林，男，檢驗(yàn)師，碩士。

羅清，男，就讀南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，碩士研究生。