樹突狀細胞/腫瘤細胞融合誘導(dǎo)的抗肺癌 CTL作用的初步究

程廣翠 謝清泉

樹突狀細胞(DC)是目前鑒定的最有效的抗原遞呈細胞(APC),自 1973年首次識別 DC以來,對 DC的研究不斷深入。DC獨特的形態(tài)、高表達抗原遞呈分子及介導(dǎo) T細胞連接、共刺激的輔助分子等生物學(xué)特性決定其在免疫學(xué)中的重要作用[1]。人類腫瘤表達大量能被 T細胞識別的蛋白質(zhì)抗原,為癌癥免疫治療提供靶位,但大多數(shù)人類腫瘤為弱免疫源性,能逃避宿主免疫系統(tǒng)?？乖f呈途徑的改變?yōu)槟[瘤特異性抗原不能向宿主遞呈的原因之一。為此改變、促進機體免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的遞呈是腫瘤免疫治療中具有實用價值的研究方向。鑒于 DC在抗原遞呈中的重要作用,以其為基礎(chǔ)設(shè)計的腫瘤疫苗日益受到重視。本研究在誘導(dǎo)人骨髓來源樹突狀細胞的基礎(chǔ)上,探討了樹突狀細胞/腫瘤細胞融合特異性抗肺癌免疫研究。

1 材料和方法

1.1 骨髓 共 6例,取自中日聯(lián)誼醫(yī)院胸外科肺癌患者手術(shù)中切下的肋骨,骨髓病理檢查證實均無癌骨髓轉(zhuǎn)移灶,為正常骨髓象。肺癌標本:共 6例,取自上述患者手術(shù)標本,均經(jīng)病理檢查確診。外周血:上述 6例患者外周血。

1.2 主要試劑 IMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、FITC標記抗CD86、HLA-DR McAb、PE標記抗 CA-199McAb、淋巴細胞分離液、rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α、 PEG-4000、3H-TdR等。

1.3 人骨髓樹突狀細胞的誘導(dǎo)及鑒定 體外誘導(dǎo):無菌取手術(shù)患者術(shù)中切下的肋骨,除去上面附著的軟組織,用PBS沖洗,再用骨鉗切為約 3～4 cm長,從一端插入事先吸入培養(yǎng)液的注射器,沖洗骨髓腔,沖洗數(shù)次,用 200目銅網(wǎng)過濾,淋巴細胞分離液(70%)分離單個核細胞,PBS洗兩次,用 15%DMEM配制成 2×105/ml單細胞懸液,培養(yǎng)于 37°,培養(yǎng)體系中加入人重組粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和白介素-4(rhIL-4)誘導(dǎo)骨髓單個核細胞在體外產(chǎn)生樹突狀細胞。

1.4 DC表型分析 收集培養(yǎng) 10 d的DC與抗體CD86、HLADR作免疫熒光染色及FACS分析。

1.5 人肺癌細胞的原代培養(yǎng) 選取 6例中日聯(lián)誼醫(yī)院住院手術(shù)肺癌患者的手術(shù)標本,均經(jīng)病理確診。無菌取下腫瘤組織后,機械剪碎,用 0.25%胰蛋白酶消化后 5 h,收集單個細胞,DMEM洗 2次,培養(yǎng)于 15%DMEM中;經(jīng)組織學(xué)染色觀察腫瘤細胞形態(tài)學(xué)特征。

1.6 人骨髓 DC與人肺癌細胞融合及鑒定 用 50%聚乙二醇(PEC)4000融合DC與原代培養(yǎng)的肺癌細胞,DC與腫瘤細胞的比例為 6:1,PBS洗滌后,融合細胞培養(yǎng)在含 15%FCS的DMEM培養(yǎng)液中,培養(yǎng)體系中含 GM-CSF(4ng/ml)。通過以FICT-抗 HLA-DR、CD86抗體標記 DC,測定 HLA-DR、CD86表達水平。選取一株 CA 199陽性表達的細胞 DC/腫瘤細胞融合細胞,以 PE-抗 CA199和 FICT-抗 CD 86進行雙標記,同時以 DC和腫瘤細胞作對照,檢測DC與腫瘤細胞的融合效力。

1.7 CTL的產(chǎn)生及細胞毒性的測定 以 20,000rad劑量照射DC單獨(1.7×106/鼠)、腫瘤細胞單獨(B 16或 3LL)(3×105/鼠)、DC單獨、DC與腫瘤細胞同時加入、抗原肽刺激 DC、DC/腫瘤細胞融合瘤苗后,上述細胞再與同源 PBMC共同培養(yǎng) 3 d,而后與原代培養(yǎng)細胞共同培養(yǎng) 5 d,摻入 3H-TdR 18 h后,收集細胞,測定放射性核素閃爍記數(shù)值。

2 實驗結(jié)果

2.1 樹突狀細胞的誘導(dǎo) 在培養(yǎng)的前 7 d,無明顯細胞集聚體出現(xiàn),加入 GM-CSF、TNF-α繼續(xù)培養(yǎng) 3～5 d,出現(xiàn)典型的成熟樹突狀細胞,見圖 1。

圖1 人骨髓來源的樹突狀細胞的形態(tài)學(xué)觀察(200×)

2.2 肺癌細胞的原代培養(yǎng) 如圖 2所示,6例原代培養(yǎng)肺癌細胞均呈上皮型,細胞形態(tài)多樣,多呈多角型,核:漿比例增加,核深染。

圖2 原代培養(yǎng)肺癌細胞(瑞氏染色)

2.3 人骨髓DC/肺癌細胞融合誘導(dǎo)的CTL的細胞毒性 見表1。結(jié)果表明DC/肺癌細胞融合在體外能有效誘導(dǎo)CTL產(chǎn)生,后者對靶細胞產(chǎn)生較強的細胞毒作用;以抗原肽刺激DC或DC/肺癌細胞同時加入誘導(dǎo) CTL的培養(yǎng)體系,亦誘導(dǎo)出一定的CTL活性,但其對靶細胞的殺傷效力顯著低于融合瘤苗誘導(dǎo)的 CTL。

表1 人DC融合疫苗的體外誘導(dǎo)殺傷作用

3 討論

DC在抗原遞呈中發(fā)揮重要作用,以其為基礎(chǔ)設(shè)計的腫瘤疫苗日益受到重視。以腫瘤抗原肽、腫瘤細胞裂解物、腫瘤細胞RNA等體外沖擊或?qū)AA基因轉(zhuǎn)染到 DC內(nèi),均被認為是頗有前途的疫苗制備方案[2]。但這些體外沖擊手段均具有半衰期短等缺點。DC與腫瘤細胞融合具有以下優(yōu)點:融合細胞使天然抗原性腫瘤蛋白遞呈到細胞表面的MHC-肽復(fù)合物中、在體內(nèi)可產(chǎn)生相對穩(wěn)定、持續(xù)的抗原加工和遞呈、完整的腫瘤細胞與 DC的融合使多種未知、未鑒定的腫瘤抗原共同參與免疫宿主。

國內(nèi)外有關(guān)DC/腫瘤細胞融合疫苗的構(gòu)建的相關(guān)研究主要局限在動物實驗水平,如DC與肥大細胞瘤細胞[3]、腎細胞癌融合等,但在2004年后半年以來,國外此方面的報道增多,如美國的最新一篇報道中介紹了人源DC/乳腺癌、卵巢癌細胞融合疫苗的實驗研究[4-6]。但到目前為止尚未見有關(guān)人源DC/自體肺癌細胞融合疫苗的報道。國內(nèi)人源 DC/腫瘤細胞融合疫苗的研究只是局限于正常人外周血來源 DC,所應(yīng)用的腫瘤細胞均為細胞系,未能為發(fā)展個體化瘤苗提供一定理論依據(jù)[7-9]。

本研究結(jié)果表明DC/肺癌細胞融合在體外對靶細胞產(chǎn)生較強的細胞毒作用,其 CTL活性顯著高于以抗原肽刺激DC或DC/肺癌細胞同時加入培養(yǎng)體系誘導(dǎo) CTL。本研究結(jié)果作為DC融合瘤苗的個體化治療的初步探索性工作,將為其進一步廣泛應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。

本研究進一步證實 DC與腫瘤細胞融合技術(shù)制備的腫瘤疫苗代表一類更為有效的抗腫瘤免疫策略。我們推測 DC融合瘤苗在荷瘤個體腫瘤的綜合治療、預(yù)防腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

盡管有關(guān) DC融合瘤苗的研究取得一定進展,但幾乎所有研究均集中在DC融合瘤苗的抗腫瘤作用及其機制等研究方面,由于DC與腫瘤抗原融合后遞呈的抗原成分極其復(fù)雜,應(yīng)用于機體也可能引起免疫系統(tǒng)其他復(fù)雜變化,因此在今后的研究中需對DC融合瘤苗的可能副作用進行深入、廣泛的探討。

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