α2,8-唾液酸轉移酶VI過量表達影響小鼠乳腺癌細胞基因表達的研究*

時 瀚,顧玉超,徐 良,于文功

(中國海洋大學醫(yī)藥學院分子生物學實驗室,山東青島266003)

α2,8-唾液酸轉移酶VI過量表達影響小鼠乳腺癌細胞基因表達的研究*

時 瀚,顧玉超,徐 良,于文功**

(中國海洋大學醫(yī)藥學院分子生物學實驗室,山東青島266003)

研究α2,8-唾液酸轉移酶VI(Sixth type ofα2,8-sialyltransferase,ST8Sia VI)對乳腺癌細胞生物學功能的影響及其作用的分子機制。采用全基因組芯片技術檢測ST8Sia VI過表達前后小鼠乳腺癌細胞4T1基因表達譜的差異;利用PathwayExplorer分析ST8Sia VI過表達前后對基因網絡的影響。實驗結果表明:ST8Sia VI過表達引起201個基因表達有差異,其中22個基因與腫瘤細胞的黏附、生長、運動、免疫和周期有關。另外,PathwayExplorer分析結果顯示,差異表達基因涉及的最顯著變化的基因網絡是“依賴β -arrestin的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)信號通路”;進一步的實驗結果證明該通路下游Raf蛋白的磷酸化水平在ST8Sia VI過表達細胞顯著升高。上述結果為ST8Sia VI生物學功能的深入研究提供了前提。

唾液酸修飾;ST8Sia VI;基因表達;Raf激酶

唾液酸(Sialic acid)是帶有負電荷的九碳糖,位于糖蛋白與糖鞘脂寡糖鏈末端,具有重要的生物學功能[1-2]。α2,8-唾液酸修飾的聚糖存在于脊椎動物成體、形成期和轉化期胚胎細胞中[3]。至少有6種α2,8-唾液酸轉移酶參與α2,8-唾液酸修飾。目前,多數(shù)研究針對糖鞘脂和糖蛋白N-聚糖α2,8-唾液酸修飾[4],而對O-聚糖的α2,8-唾液酸修飾研究較少[5]。O-聚糖在免疫應答、造血系統(tǒng)的發(fā)育及精卵結合等方面發(fā)揮重要作用[3]。小鼠ST8Sia VI基因2002年被克隆[6],其編碼α2,8-唾液酸轉移酶家族的1個新成員,也是本家族中第一個被報道的催化O-聚糖唾液酸修飾的糖基轉移酶。該酶可在糖蛋白和糖鞘脂糖基非還原端NeuAcα2,3(6)Gal序列上添加1個α2,8連接的唾液酸,形成NeuAcα2,8NeuAc雙唾液酸結構,但不形成寡聚或多聚唾液酸結構。另外,ST8Sia VI主要以糖蛋白上的O-聚糖為底物,而催化N-聚糖和糖鞘脂唾液酸修飾的活性較低。2005年,人ST8Sia VI(hST8Sia VI)基因被克隆[7],hST8Sia VI也能催化O-聚糖糖鏈末端形成雙唾液酸結構。迄今為止,對ST8Sia VI的研究僅限于酶學性質方面,沒有涉及ST8Sia VI對細胞生物學功能的影響[8]。

本研究首次在小鼠乳腺癌4T1細胞株中實現(xiàn)了ST8Sia VI基因過表達,并利用小鼠基因表達譜寡核苷酸芯片分析了ST8Sia VI過表達細胞株與對照細胞株差異表達的基因,對差異表達基因進行了功能歸類,并在現(xiàn)有基因網絡數(shù)據庫搜索了ST8Sia VI顯著相關的基因網絡。

1 材料與方法

1.1 細胞與培養(yǎng)基

小鼠乳腺癌細胞株4T1[9]為美國Karmanos Cancer Institute的Fred R.Miller教授惠贈。人逆轉錄病毒包裝細胞株Phoenix A為本實驗室保存。細胞培養(yǎng)用DME-10培養(yǎng)基(Dulbeccoπs Modified Eagleπs Medium,DMEM,10%胎牛血清和1%非必需氨基酸)。

1.2 儀器及試劑

7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems,Singapore);高容量cDNA反轉錄試劑盒(Applied Biosystems,USA);SYBR-Green Master PCR Mix(Applied Biosystems,USA);Trizol(Invitrogen,USA);細胞膜蛋白提取試劑盒(Biovision,USA);N-糖苷酶F(Takara,Japan);ECL化學發(fā)光試劑(GE Healthcare,USA);小鼠單克隆抗體S2-566(Seikagaku Co.,Japan);其它抗體均購自美國Cell Signaling公司。

1.3 過表達細胞株的建立

逆轉錄病毒載體pMSCVpuro由本實驗室保存,小鼠pRc/CMV-ST8Sia VI質粒為日本RIKEN的Takashima教授惠贈。小鼠的ST8Sia VI基因被插入到pMSCVpuro載體的EcoRI位點,獲得過表達載體pMSCVpurO-ST8Sia VI。用磷酸鈣法將pMSCVpuro和pMSCVpurO-ST8Sia VI質粒分別轉染Phoenix A細胞,48 h后收集含有病毒顆粒的培養(yǎng)基上清,然后感染4T1細胞48 h。在含有4μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基中篩選兩周,從而得到穩(wěn)定感染的細胞株:穩(wěn)定表達ST8Sia VI的細胞株4T1-ST8Sia VI及轉染空載體的細胞株Control。

1.4 半定量RT-PCR和實時定量PCR

用Trizol試劑提取細胞總RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性,紫外分光光度計定量,檢測純度。反轉錄按照反轉錄試劑盒步驟進行。半定量RT-PCR所用引物為:小鼠β -actin正向引物序列:5′-ATCTGGCACCACACCTTCTAC-3′,反向引物序列:5′-CACACTTCATGATGGAATTGAA-3′。小鼠ST8Sia VI基因正向引物序列:5′-GGCTGTTGATGGA GGGAA-3′,反向引物序列:5′-TTGTGA TGGTCTGGAGGTAGTC-3′;反應條件:94℃預變性4 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共進行30個循環(huán)后,72℃延伸10 min。以小鼠β -actin基因作為內參。

實時熒光定量PCR反應使用SYBR Green Master PCR mix試劑盒,基因引物見表1,實驗操作按照試劑盒說明書進行。反應條件:95℃預變性10 min,95℃變性15 s,60℃退火、延伸60 s,40個循環(huán),72℃延伸5 min。以GAPDH的表達為內參,目的基因相對定量比值為2-(Ct-Cc)。

表1 實時定量PCR基因引物序列Table 1 Primer sequences of genes in real-time RT-PCR

1.5 基因芯片分析

1.5.1 芯片 小鼠16 K基因表達譜寡核苷酸芯片(V1.0)(SBC-R-MO-100-10)是由上海生物芯片有限公司提供。芯片覆蓋基因16 463個,寡核苷酸片段長度為70個堿基。

1.5.2 探針的標記 參照Schena等的方法[10],將樣品RNA經逆轉錄反應制成帶熒光標記的cDNA探針并純化,來源于實驗組4T1-ST8Sia VI細胞的mRNA用Cy3-dU TP標記制成探針,對照組Control細胞的mRNA用Cy5-dU TP標記制成探針。

1.5.3 雜交和洗片 將探針置于芯片上,用蓋玻片覆蓋,置于雜交艙中,放入42℃雜交箱內雜交過夜(16～18 h)。雜交結束后,先在42℃含0.2%SDS,2×SSC的液體中洗5 min,而后在0.2×SSC中室溫洗5 min,玻片甩干后即可用于掃描。

1.5.4 檢測和分析 對基因芯片用Agilent(Axon)掃描儀掃描,用GenePix Pro 3.0圖像分析軟件對芯片灰度掃描圖進行分析。為了校正Cy5、Cy3標記體系間的系統(tǒng)誤差,實驗數(shù)據進行均一化處理,計算Cy3和Cy5的比值。差異基因篩選標準:Cy3/Cy5比值>或=2(上調)及<或=0.5(下調)。

1.5.5 數(shù)據分析 對篩選出的差異表達基因進行聚類分析(網址:http://david.abcc.ncifcrf.gov/,http://www.biorag.org/query.php),列出部分基因功能。利用PathwayExplorer(https://pathwayexplorer.genome.tugraz.at/)在線分析工具[11],分別在KEGG、BioCarta和GenMAPP基因網絡搜索唾液酸轉移酶ST8Sia VI調控的基因顯著相關基因網絡。PathwayExplorer采用χ2Fisherπs精確性檢驗和錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)法進行顯著性分析,FDR結果用q值表示。

1.6免疫印跡(Western Blot)分析

蛋白糖基化水平檢測:收集細胞,用細胞膜蛋白提取試劑盒提取細胞膜蛋白。膜蛋白樣品50μg及N-糖苷酶F(N-glycosidase F)處理的膜蛋白樣品50μg經SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜,依次用抗體S2-566和辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG+IgM(H+L)抗體孵育,混合ECL試劑進行顯影,暗室內膠片感光,然后漂洗定影。

蛋白磷酸化水平檢測:用RIPA裂解液(50 mmol/L Tris-HCl p H 7.5,150 mmol/L NaCl,0.1%SDS,1%NP40,0.5%脫氧膽酸鈉,100μg/mL PMSF,1μg/mL Aprotinin,2μg/mL Leupeptin,1 mmol/L DTT)裂解細胞,分離上清,取50μg總蛋白進行免疫印跡分析(操作同上),分別與抗phosphorylated(Ser338)Raf(p-Raf),Raf和β -Actin抗體4℃孵育過夜,ECL法檢測。實驗重復3次以上,所有結果均采用Image-Pro Plus軟件(version 6.0;Media Cybernetics,Bethesda,MD,USA)分析。

2 結果

2.1 穩(wěn)定表達ST8Sia VI細胞株的建立

感染后的細胞經過有限稀釋法篩選,獲得穩(wěn)定表達ST8Sia VI的細胞株4T1-ST8Sia VI及轉染空載體的4T1細胞株Control(作為對照)。RT-PCR結果表明,Control細胞不表達ST8Sia VI基因,而4T1-ST8Sia VI細胞高表達ST8Sia VI(見圖1)。

圖1 乳腺癌細胞中ST8Sia VI的表達Fig.1 Expression of ST8Sia VI in breast cancer cells

從Control細胞和4T1-ST8Sia VI細胞中制備細胞膜蛋白,利用識別糖鏈非還原末端NeuAcα2,8NeuAcα2,3Gal結構的單克隆抗體S2-566進行Western Blot實驗,分析細胞膜上蛋白的唾液酸修飾。如圖2所示,ST8Sia VI過表達細胞(泳道2)膜蛋白含有NeuAcα2,8NeuAcα2,3Gal結構的糖鏈的量顯著高于Control細胞(泳道1)。利用N-糖苷酶F消化去除N-糖鏈后,Control細胞膜蛋白的大多數(shù)條帶都消失(泳道3),而4T1-ST8Sia VI細胞仍然存在一些明顯的條帶(泳道4),表明4T1-ST8Sia VI細胞膜蛋白的O-聚糖α2,8唾液酸修飾顯著增加。上述實驗結果從mRNA水平和蛋白水平證明了ST8Sia VI過表達細胞株建立成功。

2.2 全基因組芯片分析

為了探討ST8Sia VI作用的分子基礎,利用小鼠全基因組芯片比較分析了對照細胞和ST8Sia VI過表達細胞的基因表達,發(fā)現(xiàn)共有201個差異表達的基因,153個在4T1-ST8Sia VI細胞中被上調,48個被下調。其中與腫瘤細胞的生物功能(細胞黏附,細胞生長,細胞運動,免疫和細胞周期)有關的基因共有22個(見表2):與細胞黏附相關的基因共有7個,其中5個上調,2個下調;與細胞運動能力相關的7個基因均上調;與細胞生長相關的Net1上調,Nov下調;與免疫相關的3個基因中有1個下調;調節(jié)細胞周期的基因有1個上調,2個下調。

為了證實芯片結果的可信度,采用實時定量PCR技術對從芯片結果中隨機選取的4個基因進行驗證。4個基因的定量PCR結果與芯片結果基本一致,表明芯片結果可信(見圖3)。

圖2 免疫印跡分析ST8Sia VI對4T1細胞唾液酸修飾的影響Fig.2 Western blot analysis of the effect of sialic modification by ST8Sia VI on 4T1 cells

圖3 定量PCR檢測對照細胞和ST8Sia VI過表達細胞中Profilin2,Moesin,Nov和Tgm2的表達量Fig.3 Quantitative PCR analysis of Profilin2,Moesin,Nov and Tgm2 expressions in Control and 4T1-ST8Sia VI cells

表2 4T1-ST8Sia VI與Control細胞間差異表達的基因Table 2 The genes differentially expressed in 4T1-ST8Sia VI and Control cells

2.3 差異表達基因的Pathway分析

以KEGG、Biocarta和GenMAPP基因網絡數(shù)據庫為基礎,應用PathwayExplorer在線軟件對變化基因進行Pathway分析。與已知的小鼠545條信號通路比對,結果發(fā)現(xiàn),Fisherπs精確性檢驗P<0.05和FDR明顯性檢驗q<0.05的基因網絡只有1個,為依賴β -arrestin的GPCR信號通路(P=0.002,q=0.039),有8個基因與該通路匹配(表3)。

為了進一步探討唾液酸轉移酶ST8Sia VI對依賴β -arrestin的GPCR信號通路的影響,檢測該通路下游Raf蛋白的磷酸化水平變化。由圖4發(fā)現(xiàn),與Control細胞比較,4T1-ST8Sia VI細胞的Raf蛋白磷酸化水平提高約2.66倍,提高顯著(P<0.01)。因此,ST8Sia VI可以調控依賴β -arrestin的GPCR信號通路,與芯片Pathway分析結果相符。

3 討論

基因芯片技術是1種基于片基表面基因特異性雜交的高通量研究基因表達信息的新技術?；虮磉_譜或“轉錄組”是指從基因組DNA轉錄或表達的基因整體,它決定著細胞蛋白質組的表現(xiàn)型和功能。通過基因表達譜,可以預測基因間的調節(jié)機制和生化途徑的線索,以及藥物在疾病治療方面的作用靶基因和作用機制[12]。在本研究中,利用基因芯片技術研究了唾液酸轉移酶ST8Sia VI對4T1細胞基因表達的影響,發(fā)現(xiàn)ST8Sia VI調控的基因涉及到細胞生長、細胞黏附、細胞運動等多方面功能。例如:與細胞生長相關的Net1(神經上皮細胞轉化基因1)上調,Net1是1個腫瘤增殖相關蛋白,作為RhoA激活蛋白穿梭于細胞核與細胞質間,在癌細胞漿中積聚賦予了癌細胞更顯著的浸潤和轉移潛能,且在人類一些癌細胞中是過表達的,尤其可作為人類乳腺癌診斷的依據[13]。而與生長相關的Nov(腎母細胞瘤過度表達基因)下調,Nov是1種胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factor,IGF)結合蛋白,屬于IGF家族的成員。Nov可以抑制腫瘤的生長以及形成,在調節(jié)腫瘤細胞的生長方面起著重要的作用[14]。又如芯片結果顯示,與細胞運動相關的Moesin(膜組織伸展刺突蛋白)與Profilin2(肌動蛋白抑制蛋白2)上調。Moesin屬于ERM(Ezrin,Radixin,Moesin)家族成員之一,對維持細胞形態(tài)及運動起重要作用[15]。而Profilin2可與自由單體肌動蛋白和F-actin的末端結合,以影響肌動蛋白的聚合、解聚以及對肌動蛋白細胞骨架結構和功能的改變[16]。此外,ST8Sia VI過表達后,與細胞黏附相關的Tgm2(轉谷氨酰胺酶2)被下調。許多ECM蛋白是Tgm2的催化底物,Tgm2可以通過對ECM的催化來抑制血管生成和腫瘤生長[17]。

表3 與GPCR信號通路匹配的基因Table 3 Genes matching GPCR signaling pathway

圖4 免疫印跡分析GPCR通路中Raf蛋白的磷酸化變化Fig.4 Western Bolt analysis of Raf phosphorylation in the GPCR pathway

另一方面,基因表達數(shù)據隱含基因間的相互作用信息,因而可以通過分析基因表達數(shù)據,構建基因調控網絡。而基因網絡水平的分析能更加具體的揭示機體組織和細胞生理過程或狀態(tài)的變化及其可能的發(fā)展趨勢[18]。本研究中,在現(xiàn)有基因網絡數(shù)據庫搜索了唾液酸轉移酶ST8Sia VI影響4T1細胞的顯著相關的基因網絡,發(fā)現(xiàn)了依賴β -arrestin的GPCR信號通路,該通路可進一步激活下游的MAPK通路[19]。MAPK通路是細胞內1條十分重要的信號傳遞途徑,該通路的激活與細胞的生長和運動有密切的聯(lián)系。而Raf是Ras-Raf-MEK-MAPK級聯(lián)反應中的一個重要蛋白,并且Raf-MAPK的活化可介導增殖和定向性細胞遷移。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)Raf的磷酸化水平有了明顯的提高,因此推測唾液酸轉移酶ST8Sia VI對于4T1細胞生長和運動的影響可能是通過調節(jié)依賴β -arrestin的GPCR信號通路實現(xiàn)的。

總之,本文的研究結果表明,唾液酸轉移酶ST8Sia VI可能通過修飾4T1細胞表面的蛋白多糖來直接或者間接調控細胞的生長、運動、黏附、免疫等相關基因及信號傳導通路,為深入研究ST8Sia VI作用的分子機制提供了理論基礎。

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Study on the Effect of an Over-Expressed Sixth Type ofα2,8-sialyltransferase(ST8Sia VI)on the Gene Expression of Murine Breast Cancer Cells

SHI Han,GU Yu-Chao,XU Liang,YU Wen-Gong
(Department of Molecular Biology,School of Medicine and Pharmacy,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

This study aimed at clarifying the roles and molecular mechanisms of the sixth type of sialyltransferase(ST8Sia VI)in breast cancer cells.In this study,the gene expression of 4T1 cells over-expressed ST8Sia VI and 4T1 cells transfected empty vector were compared by gene chip,and the related signal pathways of differentially expressed genes were determined based on the public databases with PathwayExplorer.The results showed that the expressions of 201 genes were differential in ST8Sia VI over-expressed cells and control cells,of which 22 genes were involved in cell adhesion,growth,locomotion,immune process and cell cycle.The genes expressed differentially were also involved inβ -arrestindependent GPCR signaling pathway.In addition,Raf,a downstream member ofβ -arrestin-dependent GPCR signaling pathway,was found to be highly phosphorylated in 4T1-ST8Sia VI cells.These results lay the foundation for an in-depth study of ST8Sia VI.

sialylated modification;ST8Sia VI;gene expression;Raf

Q786

A

1672-5174(2010)01-047-07

國家重點基礎研究發(fā)展規(guī)劃項目(2003CB716402)資助

2008-12-22;

2009-04-20

時 瀚(1980-),女,博士。E-mail:zhtshh@163.com

**通訊作者:Tel:0532-82031680,E-mail:yuwg66@ouc.edu.cn

責任編輯 于 衛(wèi)