梭魚(yú)和青鳉魚(yú)ERα介導(dǎo)的雌激素活性比較研究

郝麗妮 ,趙硯彬 ,彭 輝 ,黃 崇 ,陳樹(shù)林 ,胡建英 * (.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西 楊凌700；.北京大學(xué)城市與環(huán)境學(xué)院,北京 0087)

環(huán)境雌激素類(lèi)物質(zhì)(EES)能夠模擬魚(yú)體內(nèi)激素的作用模式,干擾魚(yú)類(lèi)內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能,從而影響魚(yú)類(lèi)的性腺分化,導(dǎo)致多種魚(yú)雌雄同體現(xiàn)象發(fā)生[1-3].EES的一種重要的作用模式是通過(guò)與雌激素受體(ER)結(jié)合,調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)[4].其中雌激素受體(ER)介導(dǎo)的化學(xué)物質(zhì)如 17β-雌二醇(E2)、雌酮(E1)、雌三醇(E3)、17α-炔雌醇(EE2)等天然和人工合成的ER均能在實(shí)驗(yàn)室暴露中誘導(dǎo)模式魚(yú)類(lèi)如青鳉魚(yú)雌雄同體的發(fā)生[5-6].然而在野外調(diào)查中發(fā)現(xiàn),許多魚(yú)類(lèi)在低于實(shí)驗(yàn)室暴露濃度的條件下就發(fā)生雌雄同體現(xiàn)象,其中可能的的原因有:(1)實(shí)際環(huán)境中的暴露是多物質(zhì)多途徑的暴露過(guò)程;(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和野生魚(yú)類(lèi)對(duì)污染物的敏感性不同[7].

關(guān)于 ER物種敏感性差異的問(wèn)題,已有較多研究[7-13].Matthews等[8]研究發(fā)現(xiàn)雙酚A、t-辛基酚(OP)及o, p-DDT與虹鱒ERα的結(jié)合能力約比人和老鼠ERα受體高10倍,Hiroshi等[9]發(fā)現(xiàn)壬基酚(NP)、OP與鳉(Mummichog)的ERα結(jié)合活性是人的50倍.基于這些研究背景,最近 OECD正考慮將不同魚(yú)類(lèi) ERs的體外試驗(yàn)方法列入內(nèi)分泌干擾物質(zhì)的環(huán)境管理和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中[14].梭魚(yú)(So-iuy mullet,Mugil soiuy)是沿海地區(qū)一種重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi),對(duì)我國(guó)遼東灣野生梭魚(yú)的性腺切片觀察統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)其雌雄同體的發(fā)生率高達(dá)54.5%,遠(yuǎn)高于其他調(diào)查魚(yú)種[15].因此有必要建立梭魚(yú)ER物種特異性的體外測(cè)試方法,從ER物種敏感性差異的角度對(duì)遼東灣梭魚(yú)雌雄同體現(xiàn)象高發(fā)的成因進(jìn)行解析.

酵母雙雜交技術(shù)是一套采用報(bào)告基因來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)間相互作用的技術(shù)[16].與哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)相比,酵母細(xì)胞培養(yǎng)成本低,穩(wěn)定性好,是OECD推薦使用的一種比較理想的高通量環(huán)境污染物初篩工程菌[14].因此本研究通過(guò)克隆梭魚(yú) ERα(sERα),建立了 sERα活性物質(zhì)物種特異性的酵母雙雜交篩選方法.并在此酵母系統(tǒng)中比較了4種環(huán)境中普遍存在的典型雌激素活性物質(zhì)(E1,E2,E3和 EE2)對(duì) sERα和青鳉魚(yú)ERα(mERα)誘導(dǎo)活性的差異, 以期從雌激素受體物種敏感性差異的角度探討梭魚(yú)雌雄同體發(fā)生率高的原因.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用梭魚(yú)為遼東灣野生梭魚(yú);Y190酵母菌株、pGAD424-TIF2質(zhì)粒、改造多克隆位點(diǎn)的pGBT9 質(zhì)粒(EcoR I, Sac I, Bam I, Nde I, Hind Ⅲ,Cla I, Not I, Pst I)、青鳉魚(yú) ERα-TIF2 酵母由日本Gifu Pharmaceutical大學(xué) Tsuyoshi Nakanishi 教授惠贈(zèng);雌激素E1、E2、E3、EE2均購(gòu)買(mǎi)于日本東京化成,測(cè)試前用二甲基亞砜(DMSO,ACS級(jí),AMRESCO)配成100mmol/L儲(chǔ)備液備用.

1.2 梭魚(yú)ERα DEF片段的分子克隆

1.2.1 梭魚(yú) ERα基因 cDNA部分片段的克隆快速分離梭魚(yú)肝臟組織,利用 Trizol法提取梭魚(yú)肝臟總 RNA.以所提總 RNA為模板,oligo(dT)15為逆轉(zhuǎn)錄引物,使用 MMLV(INVOTROGEN)反轉(zhuǎn)錄酶,反轉(zhuǎn)錄得到梭魚(yú) cDNA.根據(jù)與梭魚(yú)在形態(tài)學(xué)分類(lèi)上相近的其他魚(yú)種的己知ERα基因序列,在 ERα 基因 DBD(DNA-binding domain)區(qū)和LBD(Ligand-binding domain)區(qū)分別選擇氨基酸保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物 sER1,sER1′及 sER2,sER2′(引物序列見(jiàn)表 1).以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板,使用 KOD PLUS高保真DNA聚合酶(TOYOBO),用 sER1,sER1′引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:94℃ 2min,然后94℃ 15s、53℃30s,68℃ 1min進(jìn)行35個(gè)循環(huán),反應(yīng)體積為 50μL.以上述PCR產(chǎn)物為模板,sER2,sER2′為引物,再次進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件同上,退火溫度變?yōu)?8°C.用 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物,切膠回收、純化約820bp的片段,測(cè)序.

表1 梭魚(yú)ERα基因擴(kuò)增及測(cè)序引物Table 1 PCR and sequencing primers for cloning of So-iuy mullet sequences

1.2.2 梭魚(yú)ERα基因3′端cDNA擴(kuò)增 在己測(cè)序的梭魚(yú)ERα基因序列中設(shè)計(jì)2個(gè)3′-RACE上游引物 sER3-1和sER3-2,下游引物記為SER3′由試劑盒提供(3′-Full RACE Core Set, Takara ).首先以加接頭的oligodT-3′為引物反轉(zhuǎn)錄梭魚(yú)總RNA,并以轉(zhuǎn)錄出的cDNA為模板,sER3-1,sER3′為引物進(jìn)行第一輪PCR,接著以第一輪PCR的產(chǎn)物為模板,sER3-2、sER3′為引物,進(jìn)行第二輪擴(kuò)增,兩輪PCR反應(yīng)的條件均為:94°C 2min,然后94°C 15 s,55°C 30 s,68°C 2min循環(huán)35次.1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物,切膠回收約840bp的片段,測(cè)序.

1.2.3 梭魚(yú)ERα基因DEF片段擴(kuò)增 根據(jù)己測(cè)序的梭魚(yú)ERα基因的序列,設(shè)計(jì)引物sER4, sER4′及加接頭引物 sER5,sER5′.用兩對(duì)引物依次進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:94°C 2min,然后94°C 15 s,退火溫度(第一輪 53°C,第二輪 62°C) 30 s,68°C 1.5 min做35個(gè)循環(huán),PCR純化試劑盒(碧云天生物試劑公司)純化第二輪擴(kuò)增出的片段,得到約1100bp的梭魚(yú)ERα基因 DEF片段.用EcoR I和Cla I內(nèi)切酶(NEB)在37°C下雙酶切5h后,純化得到帶黏性末端的梭魚(yú)ERα基因DEF片段.

1.2.4 PCR產(chǎn)物的鑒定及序列分析 需要測(cè)序的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,純化后,連接到平端載體上(pEASY-Blunt Cloning Vector,全式金生物技術(shù)公司)并轉(zhuǎn)化 Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞, 用涂有X-GAL、IPTG的氨芐抗性平板篩選陽(yáng)性克隆.選取 10個(gè)菌落,擴(kuò)增接入片段時(shí)所對(duì)應(yīng)用的引物,HSTMTaq DNA聚合酶(東盛生物)進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增(反應(yīng)條件為:首先預(yù)變性 94°C 10min,然后94°C 30s, 55°C 30s,72°C 1min(擴(kuò)增時(shí)間按 900～1000bp/min 算)循環(huán)45次,最后72°C延伸10min),進(jìn)一步鑒定陽(yáng)性克隆,并選3個(gè)克隆提取質(zhì)粒測(cè)序.

1.3 pGBT9-sERα DEF和pGAD424-TIF2雙雜交酵母的構(gòu)建

1.3.1 pGBT9-sERα DEF誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建 首先,用EcoR I和Cla I內(nèi)切酶雙酶切pGBT9 載體(37°C,反應(yīng) 5h),酶切產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳分離后,切膠回收(膠回收試劑盒, Promega公司)約5500bp的片段,并連接(T4 DNA連接酶,NEB )此回收產(chǎn)物與 sERα-DEF片段,載體片段比例約為0.03pmol:0.3pmol,25°C 反應(yīng) 15min.最后用10μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5α,測(cè)序鑒定.

1.3.2 pGAD424-TIF2靶質(zhì)粒的鑒定 用 1μL靶質(zhì)粒 pGAD424-TIF2轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸 DH5α,篩選陽(yáng)性克隆,并用P3、P3′引物測(cè)序鑒定.

1.3.3 雙質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)染酵母Y190細(xì)胞Y190酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)染方法參考 Clontech PT3024-1酵母操作手冊(cè).首先用pGBT9-sERα質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Y190酵母感受態(tài)細(xì)胞,取 200μL轉(zhuǎn)化溶液涂布于色氨酸缺陷(SD/-Trp)選擇平板上,于30°C培養(yǎng)2～3天待長(zhǎng)出菌落后PCR鑒定轉(zhuǎn)化菌株[17].從平板上挑取1～8號(hào)克隆至SD/-Trp液體培養(yǎng)基中,于 30°C,250r/min 培養(yǎng) 16～18h 后,取1mL 菌液,以12000r/min離心1min棄上清,并在沉淀中加入20μL含2.5mg/mL溶菌酶的Z buffer溶液,震蕩混勻,37°C靜置反應(yīng) 5min;取其中2μL做模板,以S5,S5′為引物,PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性94°C 10min;然 后94°C 30s,55°C 30 s,72°C 1.5min做 50個(gè)循環(huán),最后72℃延伸 10min.擴(kuò)增得到長(zhǎng)約1100bp片段的克隆,記為S1.

同上制備S1酵母感受態(tài)細(xì)胞,將pGAD424-TIF2質(zhì)粒轉(zhuǎn)入S1細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染液涂布于色氨酸、亮氨酸雙陷平板(以下簡(jiǎn)稱為SD/-Trp-Leu)上,30°C 培養(yǎng) 2～3d 后,用 P2,P2′引物做 PCR 鑒定陽(yáng)性克隆.

1.4 酵母雙雜交測(cè)試方法

具體操作按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行[18]. EC50值用Graphpad Prism 4.0軟件計(jì)算.

2 結(jié)果與討論

2.1 梭魚(yú)ERα的分子克隆及鑒定

利用RT-PCR和RACE 技術(shù),PCR擴(kuò)增得到1113bp的基因片段,測(cè)序結(jié)果在 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上比對(duì),證明所擴(kuò)片段是梭魚(yú)的ERα基因片段(圖1).采用Krust等[19]的劃分方法,所擴(kuò)梭魚(yú)ERα基因片段可劃分為DEF區(qū).氨基酸序列同源比對(duì)結(jié)果表明,梭魚(yú)ERα的DEF區(qū)與鯔魚(yú),青鳉魚(yú),人的同源性分別為92%,79%,50%.其中E/F區(qū)與青鳉魚(yú)的同源性為82%(人為56%),D區(qū)與青鳉魚(yú)的同源性僅為72% (人為36%)(圖2),說(shuō)明序列上的差異可能導(dǎo)致梭魚(yú)、青鳉魚(yú)和人ERα功能的差異.

圖1 梭魚(yú)ERα DEF區(qū) cDNA序列與對(duì)應(yīng)的氨基酸Fig.1 Nucleotide sequence of So-iuy mullet estrogen receptor DEF fragments and the deduced amino acid sequence

2.2 sERα-TIF2雙雜交酵母的構(gòu)建及誘導(dǎo)活性測(cè)試

酵母雙雜交系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于內(nèi)分泌干擾物質(zhì)的受體結(jié)合活性測(cè)試[14],目前在關(guān)于受體LBD區(qū)的劃分上仍然存在分歧,如將D區(qū)、E區(qū)和部分F 區(qū)劃入受體的LBD區(qū)[8],或者只將E區(qū)劃入LBD區(qū)[19].本研究中,首先僅將E/F區(qū)片段接入sERα-TIF2酵母系統(tǒng),測(cè)試發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照物E2對(duì)此酵母并沒(méi)有誘導(dǎo)活性,而改將DEF區(qū)接入酵母后,用E2測(cè)試具有良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系.所以本實(shí)驗(yàn)中所構(gòu)建的sERα-TIF2酵母插入的是梭魚(yú)ER的DEF區(qū),關(guān)且通過(guò)測(cè)試所購(gòu)建的酵母可以用于環(huán)境樣品的篩選.

2.3 梭魚(yú)和青鳉魚(yú)ERα介導(dǎo)的雌激素活性比較研究

用E1、E2、E3、EE2分別暴露sERα-TIF2和青鳉魚(yú)-TIF2(mERα-TIF2)雙雜交酵母,測(cè)試 4種雌激素活性物質(zhì)對(duì)兩種酵母β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)活性,劑量-效應(yīng)關(guān)系如圖3所示.

sERα與4種物質(zhì)結(jié)合的EC50分別為3.7,2.4,1.2,1699nmol/L(表2).其中EE2的相對(duì)雌激素活性(RBA)最高,為E2的2倍,E1和E3分別為E2的0.66,0.0014倍. mERα與4種物質(zhì)結(jié)合的EC50分別為17,5.7,5858,4.0nmol/L(表2),與sERα相比這4種目標(biāo)物質(zhì)同mERα的結(jié)合活性相對(duì)較低,分別是梭魚(yú)EC50的4.6,2.3,3.4,3.3倍.這表明與青鳉魚(yú)相比,梭魚(yú)ERα與某些雌激素活性物質(zhì)可能具有更高的結(jié)合活性,所以sERα敏感性是使梭魚(yú)在青鳉魚(yú)不能發(fā)生雌雄同體的野外暴露濃度下,雌雄同體高發(fā)生的可能原因之一.

圖2 梭魚(yú)、鯔魚(yú)、青鳉魚(yú)、人ERα 基因 DEF區(qū)氨基酸序列同源比對(duì)分析Fig.2 Comparison of So-iuy mullet ERα DEF amino acid sequence with flathead mullet, medaka and human

圖3 酵母系統(tǒng)中梭魚(yú)和青鳉魚(yú)ERα介導(dǎo)的雌激素活性比較(n=3)Fig.3 Comparison of ERα-mediated estrogenic binding activity between So-iuy mullet and medaka in yeast(n=3)

表2 4種雌激素的梭魚(yú)、青鳉魚(yú)ERα誘導(dǎo)活性的比較Table2 Comparison of estrogenic activities of four estrogens mediated by sERα and mERα in yeast two-hybrid system

為研究mERα與sERα結(jié)合活性的差異,本文在構(gòu)建雙雜交酵母時(shí)使用的是人的TIF2共激活因子[18,20],此系統(tǒng)可以在一定程度上反映不同雌激素活性物質(zhì)與mERα和sERα結(jié)合活性的差異.但生物體本身是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng),體內(nèi) ER的轉(zhuǎn)錄激活功能需要多種共激活因子的參與[18],所以為模擬魚(yú)類(lèi)體內(nèi)的真實(shí)環(huán)境,需要進(jìn)一步采用魚(yú)類(lèi)細(xì)胞報(bào)告基因測(cè)試方法、原代細(xì)胞培養(yǎng)甚至活體暴露等方法,最終證明 ER物種敏感性與梭魚(yú)雌雄同體高發(fā)率的關(guān)系.本酵母雙雜交體系中幾種典型雌激素物質(zhì)與sERα和mERα結(jié)合活性差異性結(jié)果為深化該研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)構(gòu)建梭魚(yú)ERα酵母雙雜交篩選系統(tǒng),證明了E1、E2、E3、EE2和梭魚(yú)ERα的結(jié)合活性均高于青鳉魚(yú)ERα,這一結(jié)果為探索遼東灣野生梭魚(yú)雌雄同體高發(fā)生率的原因提供了重要的信息.

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致謝：感謝 Tsuyoshi Nakanishi 教授惠贈(zèng) Y190酵母菌珠,pGAD424-TIF2質(zhì)粒和pGBT9質(zhì)粒.