常見石莼科綠藻的生物學(xué)特征及分子系統(tǒng)學(xué)分析*

劉 巖,劉 濤,于 丹,張 靜,王緒敏,宮慶禮**

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東青島266003;2.中國科學(xué)院北京基因組研究所,北京100029)

常見石莼科綠藻的生物學(xué)特征及分子系統(tǒng)學(xué)分析*

劉 巖1,劉 濤1,于 丹2,張 靜1,王緒敏2,宮慶禮1**

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東青島266003;2.中國科學(xué)院北京基因組研究所,北京100029)

生物學(xué)研究及種類鑒定是綠潮研究的熱點和難點之一。本文系統(tǒng)闡述了石莼科綠藻常見種類的生物學(xué)特征,探討了系統(tǒng)分類研究難點,并利用ITS、rbc L等基因序列以及質(zhì)體藍素氨基酸序列進一步研究分析了石莼科10種綠藻的序列結(jié)構(gòu)特征和分子系統(tǒng)學(xué)關(guān)系。研究顯示,石莼科滸苔屬和石莼屬綠藻rbc L和ITS序列差異未體現(xiàn)出屬間分化的差異,根據(jù)rbc L序列和ITS序列分別構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中,石莼和孔石莼、腸滸苔、扁滸苔都聚類到同一進化枝上,而裂片石莼和網(wǎng)石莼、滸苔和緣管滸苔聚類到另一進化枝上,這顯示出在分子進化水平上較為一致的結(jié)果,為滸苔屬和石莼屬系統(tǒng)分類深入研究提供一定的證據(jù);根據(jù)質(zhì)體藍素所構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中,阿氏石莼和孔石莼在NCB I上發(fā)表的質(zhì)體藍素氨基酸序列在第1進化枝中,滸苔的質(zhì)體藍素氨基酸序列在第2進化枝中。但在第1進化枝中,孔石莼的3個質(zhì)體藍素氨基酸序列沒有完全分布在同一個分支上。

石莼屬;滸苔屬;分類;ITS;rbc L

大型綠藻異常增殖現(xiàn)象越來越多地出現(xiàn)在美洲、亞洲和歐洲各國暖水性海域,這種因海水富營養(yǎng)化和異常氣候條件引起的生態(tài)學(xué)現(xiàn)象引起了廣泛地重視,為了與海洋微藻和小型浮游生物形成的赤潮(紅潮,Red tides)相區(qū)別,將其稱為綠潮(Green tides)。根據(jù)目前的報道,綠潮生物主要集中在綠藻門(Chlorophyta)石莼目(U lvales)石莼科(U lvaceae)的石莼屬(U lva)和滸苔屬(Enterom orpha)、剛毛藻目(Cladophorales)剛毛藻科(Cladophoraceae)硬毛藻屬(Chaetomorpha)及剛毛藻屬(Cladophora)。其中,以石莼屬和滸苔屬大型綠藻為常見綠潮生物種類。自20世紀末期以來,綠潮研究的重點除了發(fā)生機制及其規(guī)律的探討外,其對綠潮生物的鑒定和種群區(qū)分則是另外一個研究的熱點和難點[1-4]。本文在石莼科海藻常見海藻生物學(xué)特征的基礎(chǔ)上,將綜合有關(guān)分子學(xué)鑒定證據(jù),進一步研究和探討其分類、鑒定工作。

1 材料與方法

1.1 序列資料

選取GenBank收錄的9種石莼科海藻的ITS、rbcL等基因序列和3種石莼科海藻的質(zhì)體藍素氨基酸序列資料,其中ITS序列8條、rbcL序列9條、氨基酸序列6條(見表1、表2)。

表1 石莼科海藻的ITS序列和rbc L序列Table 1 Sequences of ITS and rbc L of Ulvaceae

表2 石莼科海藻的質(zhì)體藍素序列Table 2 Sequences of plastocyanin of U lvaceae

1.2 分析軟件

所涉及的分析軟件包括:DNASTAR和M EGA 4。計算機運行環(huán)境為window s XP。

2 結(jié)果

2.1 ITS序列分析

DNASTAR軟件分析的結(jié)果(見表3),滸苔屬和石莼屬的ITS序列的C+G%值在62.2%～65.4%之間,其中ITS1的C+G%值在65.4%～70.0%之間,ITS2的C+G%值在67.2%～74.8%之間,5.8s rDNA的C+G%值在48.1%～49.4%之間?？梢钥闯?滸苔屬和石莼屬的ITS序列的C+G%值偏高。

用DNASTAR軟件分別對滸苔屬和石莼屬的ITS1、5.8s rDNA、ITS2序列分別進行同源性分析(見表4～6)。

滸苔屬和石莼屬海藻5.8s rDNA序列高度同源,各物種間的同源性在97.5%～100%之間,長度都為160 bp,其中滸苔、緣管滸苔、裂片石莼、網(wǎng)石莼的5.8s rDNA序列完全相同。

表5 滸苔屬和石莼屬ITS1序列同源性比對結(jié)果Table 5 Homology alignment of ITS1 between U lva and Enteromorpha

滸苔屬和石莼屬的ITS1序列的同源性在70.6%～92.0%之間,其中,緣管滸苔、滸苔的同源性為91.3%,石莼、孔石莼的同源性為92.0%。其它的物種之間的同源性沒有表現(xiàn)出明顯的屬間差異,即滸苔屬和石莼屬各個物種的ITS1序列在屬間的同源性與屬內(nèi)的同源性數(shù)值相近。

表6 滸苔屬和石莼屬海藻ITS2序列同源性比對結(jié)果Table 6 Homology alignment of ITS2 between Ulva and Enteromorpha

滸苔屬和石莼屬的ITS2序列的同源性在67.7%～95.5%之間,其中裂片石莼、網(wǎng)石莼的同源性為95.5%,緣管滸苔、滸苔的同源性在93.9%,石莼、孔石莼的同源性在92.9%,扁滸苔、裂片石莼的同源性為67.7%。滸苔屬和石莼屬其他物種的ITS2序列間的同源性與其ITS1序列的同源性比對結(jié)果相近。

以基因序列研究生物的遺傳距離和系統(tǒng)進化關(guān)系時,實質(zhì)上是進行其堿基差異及其排列方式的統(tǒng)計分析。因此,序列長度及其保守性(變異率)將直接影響到最終的分析結(jié)果。因為滸苔屬和石莼屬個別物種的ITS序列差異較小,且滸苔屬和石莼屬海藻的5.8S rDNA序列高度保守,因此,在對ITS序列進行遺傳距離分析時,去除5.8S rDNA序列,用M EGA 4軟件計算滸苔屬和石莼屬海藻的ITS1和ITS2序列的遺傳距離(見表7)。

表7 滸苔屬和石莼屬海藻ITS1和ITS2序列遺傳距離Table 7 Pairw ise distances of ITS1 and ITS2 between U lva and Enteromorpha

以ITS1、ITS2序列為依據(jù),緣管滸苔、滸苔的遺傳距離為0.036 4,裂片石莼、網(wǎng)石莼的遺傳距離為0.050 3,石莼、孔石莼的遺傳距離為0.056 6,以上3組遺傳距離相對較近;裂片石莼、孔石莼的遺傳距離為0.285 1,裂片石莼、石莼的遺傳距離為0.280 9,以上2組遺傳距離相對較遠。從以上數(shù)據(jù)中可以看出,以ITS1、ITS2序列為依據(jù),滸苔屬和石莼屬各個物種間的遺傳距離分布混亂,未表現(xiàn)出明顯的屬間特異性。

用M EGA 4軟件,采用NJ分析法,以ITS1、ITS2序列對滸苔屬和石莼屬各個物種建立系統(tǒng)樹(見圖1)。

圖1 滸苔屬和石莼屬海藻ITS序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.1 Phylogenic tree of ITSof U lva and Enteromorpha

2.2 rbc L序列分析

DNASTAR軟件分析的結(jié)果(見表8),滸苔屬和石莼屬的rbc L序列的C+G%值在38.26%～39.14%之間,序列的C+G%值較低。

表8 滸苔屬和石莼屬rbc L序列長度及C+G%值Table 8 Lengths and values C+G%of rbc L of U lva and Enteromorpha

用CLASTAL X軟件對滸苔屬和石莼屬海藻rbc L基因的核苷酸序列進行比對,并用M EGA 4軟件,以rbc L基因的核苷酸序列,計算滸苔屬和石莼屬海藻的遺傳距離(見表9)。

表9 滸苔屬和石莼屬海藻rbc L基因核苷酸序列遺傳距離Table 9 Pairw ise distances of rbc L

以rbc L基因核苷酸序列為依據(jù),網(wǎng)石莼、裂片石莼的遺傳距離最近,為0.003 8。網(wǎng)石莼、條滸苔的遺傳距離為0.009 9,裂片石莼與條滸苔的遺傳距離為0.012 2,這2組的遺傳距離相對較近;石莼、條滸苔以及腸滸苔、條滸苔之間的遺傳距離值最大,為0.036 8。其它物種之間的遺傳距離數(shù)值沒有表現(xiàn)出明顯的以現(xiàn)有分類的屬為單位聚類的情況。同時,以rbc L基因的核苷酸序列為依據(jù)計算出的滸苔屬和石莼屬各個物種的遺傳距離數(shù)值要明顯小于以ITS序列為依據(jù)計算出的遺傳距離數(shù)值。

用M EGA 4軟件,采用NJ分析法,以rbc L基因核苷酸序列進一步對滸苔屬和石莼屬海藻建立系統(tǒng)樹(見圖2)。

圖2 滸苔屬和石莼屬海藻rbcL序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogenic tree of rbcL of Ulva and Enteromorpha

2.3 質(zhì)體藍素序列分析

用CLASTAL X軟件對滸苔屬和石莼屬海藻質(zhì)體藍素的氨基酸序列進行多重序列比對,并用M EGA 4軟件計算滸苔屬和石莼屬海藻的遺傳距離(見表10)。

表10 滸苔屬和石莼屬海藻質(zhì)體藍素序列遺傳距離Table 10 Pairw ise distances of p lastocyanin of U lva and Enteromorpha

以質(zhì)體藍素的氨基酸序列為依據(jù),孔石莼的1IUZ和P56274的遺傳距離為0.000,滸苔的P07465和7PCY的遺傳距離為0.000,滸苔的P07465和阿氏石莼的P13133的遺傳距離最大,為0.166 1。

用M EGA 4軟件,采用NJ分析法,以質(zhì)體藍素的氨基酸序列進一步對滸苔屬和石莼屬海藻建立系統(tǒng)樹(見圖3)。

圖3 滸苔屬和石莼屬海藻質(zhì)體藍素序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.3 Phylogenic tree of plastocyanin of Ulva and Enteromorpha

3 分析與討論

3.1 石莼科藻類的生物學(xué)特征

石莼科(U lvaceae)海藻的藻體呈葉片狀或為中空圓柱狀,由1層或2層細胞組成,葉狀體的構(gòu)造根據(jù)不同的種、屬而不同。細胞單核,有1個側(cè)生色素體,色素體內(nèi)含1至多個淀粉核,藻體基部細胞延伸成固著器。無性生殖時,產(chǎn)生游孢子,孢子囊產(chǎn)生具4根鞭毛的游孢子,成熟后經(jīng)母細胞壁的開孔逸出,游孢子萌發(fā)成具有假根的絲狀體或不規(guī)則的細胞,再進一步發(fā)育成葉狀體。有性生殖時,產(chǎn)生具雙鞭毛的配子。多數(shù)物種異配生殖,只有在不同藻體產(chǎn)生的配子間才能接合,合子立刻萌發(fā)成新藻體。石莼科藻類的生活史多數(shù)為同形世代交替,孢子體和配子體具有相同的形態(tài)特征。孢子體上營養(yǎng)細胞形成游孢子囊,核經(jīng)過減數(shù)分裂,產(chǎn)生游孢子,游孢子萌發(fā)成配子體;配子體產(chǎn)生配子,配子接合成二倍體的合子,由合子再發(fā)育成孢子體。石莼科的大多數(shù)物種分布于沿海潮間帶巖石上,少數(shù)種生于咸淡水或淡水中。

3.1.1 石莼屬海藻的生物學(xué)特征及其分類 石莼屬(U lva)海藻藻體為多細胞葉狀體,由2層細胞組成,基部由營養(yǎng)細胞延伸成假根絲,形成固著器,固著于巖石上。細胞內(nèi)有1個細胞核及1個杯狀色素體,其中含有淀粉核。生活史為雙元同形。無性生殖過程中,由孢子體邊緣的營養(yǎng)細胞開始形成孢子囊,孢子囊在形成的過程中,邊緣細胞葉綠體移往細胞的一邊,同時細胞向外生出小突起,細胞第一次分裂時的分裂面與葉狀體表面垂直,為減數(shù)分裂;第二次分裂面與第一次垂直,分成4個細胞,如此繼續(xù)分裂,每一孢子囊產(chǎn)生8～16個游孢子。孢子成熟后由囊上突起小孔逸出,游孢子具4根鞭毛,離開母體后,游動片刻,即附著在巖石上,失去鞭毛,分泌細胞壁,1～2 d內(nèi)開始萌發(fā)為配子體。有性生殖為異配生殖,由配子體形成配子囊,配子的形成與游孢子相似,但每一配子囊產(chǎn)生16～32個配子,成熟的配子亦由囊上突起的小孔逸出。配子離開母體后,進行異配接合,結(jié)合后的合子2～3 d內(nèi)開始萌發(fā),長成孢子體。配子體有時也能進行孤雌生殖。

我國近海石莼屬常見種類有以下4種:石莼(U.lactuca),孔石莼(U.pertusa),裂片石莼(U.fasciata)和礪菜(U lva.cong lobata)[5]。

(1)孔石莼(U.pertusa)藻體幼期綠色,成體為碧綠色,體形變異很大,有卵形、橢球形、披針形和圓形等,但都不規(guī)則。邊緣略有皺或稍呈波狀。藻體葉面常有大小不等不甚規(guī)則的穿孔,并且隨著藻體長大,幾個小孔可裂為一個大孔,最后使藻體形成幾個不規(guī)則的裂片狀。藻體高10～40 cm。固著器盤狀,柄不明顯。藻體單獨或2～3株叢生,中實,基部較厚。藻體橫切面觀,細胞縱長方形、角圓,長為寬的2～3倍。邊緣細胞為亞方形,長寬相似或略高,體厚70μm左右或以上。上部體厚70μm,邊緣常較薄,藻體下部逐漸增厚,約130～180μm,基部約500μm。細胞含有1個細胞核,1個大型色素體?？资粸楸碧窖笪鞑刻赜械呐瘻貛院Ｔ?生長在中潮帶及低潮帶和大干潮線附近的巖石上或石沼中。

(2)石莼(U.lactuca)藻體近似卵圓形、寬葉狀,邊緣略有波狀。藻體黃綠色,藻體長10～30 cm,藻體邊緣中實,切面觀細胞形狀為亞方形,體厚45μm左右。石莼為泛溫帶型種,生活在海灣內(nèi)、中潮帶及低潮帶的巖石或石沼中。

(3)礪菜(U.cong lobata)自藻體基部邊緣向基部深裂,形成許多裂片相互重疊呈花形。藻體鮮綠色,茂密叢生,藻體長2～4 cm,略擴展呈團塊狀。藻體邊緣中實,邊緣扭曲,切面觀細胞形狀為長方形、角圓,上部及邊緣部的細胞長度與寬度相同或略大于細胞寬度,下部細胞隨著藻體的增厚,細胞增大,細胞壁稍厚,細胞形態(tài)呈棱柱狀,細胞腔長度為寬度的1.5～2倍。藻體上部為薄膜質(zhì),上部體厚30～50μm、下部體厚100～125μm,基部稍硬。礪菜為北太平洋西部特有暖溫帶性海藻,生長在中潮帶和高潮帶巖石或石沼的邊緣。

(4)裂片石莼(U.fasciata):不規(guī)則二叉式分枝,形成或多或少的線形裂片。藻體草綠色,藻體長15～60 cm,藻體邊緣中實,葉片邊緣平滑或具有不規(guī)則的齒狀突起,有時呈波狀。藻體的基部略寬,向上分叉1～2次,并逐漸窄細。切面觀細胞形狀為長方形,細胞壁較厚,體厚70～80μm。裂片石莼為亞熱帶性海藻,生長在風浪較小的大干潮線附近的巖石或低潮帶的石沼中。

3.1.2 滸苔屬海藻的生物學(xué)特征及其分類 滸苔屬(Enteromorpha)海藻綠色,藻體單條或有分枝,圓管狀中空,有時部分稍扁。藻體無柄,成熟時從基部細胞生出假根絲形成盤狀固著器固著在基質(zhì)上。藻體壁由1層細胞組成。細胞內(nèi)有1個細胞核和1個片狀色素體,位于原生質(zhì)體的表面,一般含有1個淀粉核。滸苔屬藻類生活史為雙元同形。有性生殖過程中,由配子體產(chǎn)生2根鞭毛的配子,配子放散后經(jīng)異配接合為合子,合子萌發(fā),直接發(fā)育成新個體。配子有時進行單性生殖。滸苔屬海藻也可進行營養(yǎng)生殖,由藻體細胞直接進行有絲分裂形成分枝體,基部分生的細胞逐漸分化為假根,從藻體脫離后形成新的植株。滸苔屬約有40種,主要生活于海水和半咸水中,也可生活在含鹽的內(nèi)陸水體中。

我國近海滸苔屬常見種類有條滸苔(E.clathrata),腸滸苔(E.intestinalis),扁滸苔(E.com pressa),管滸苔(Enterom orpha.tubulosa),曲滸苔(Enteromorpha.Flexuosa),滸苔(E.prolifera)和緣管滸苔(E.linza,也稱長石莼[U.linza])等[5]。

(1)腸滸苔(E.intestinalis)藻體管狀中空,部分稍扁,單條或基部有少許分枝,高10～20 cm;直徑1～5 mm。單生或叢生,體表面常有許多皺褶或藻體扭曲。柄部圓柱形,上部膨脹如腸形。除基部細胞稍呈縱列外,藻體其他部分的細胞排列不甚規(guī)則。細胞表面觀直徑10～23μm,圓形至多角形,細胞內(nèi)有1個杯狀色素體,內(nèi)含1個淀粉核,橫切面觀偏于單層藻體的外側(cè)。全年各月都能生長和繁殖。體厚16～39μm。腸滸苔為泛冷溫帶性種,生長在海灣內(nèi)潮間帶的巖石上或石沼中,淡水流入處也可生長。

(2)滸苔(E.prolifera)藻體呈暗綠色或亮綠色,藻體長可達1～2 m,寬可達2 cm。管狀或扁壓,有明顯的主枝,多細長分枝或育枝,分枝的直徑小于主干。柄部逐漸尖細,藻體基部或至少在分枝基部的細胞排列成縱列,但上部細胞不縱列或縱列不明顯。細胞表面觀直徑16μm,圓形至多角形,細胞內(nèi)一般含1個淀粉核,有時多個,色素體不充滿。藻體厚15～18μm,可達26μm。切面觀細胞在單層藻體的中央。滸苔為溫帶性海藻,生長于中潮帶的石沼中。

(3)條滸苔(E.clathrata)藻體亮綠色或暗綠色,藻體長40 cm左右,多細長分枝,一般分枝2～3回,有時分枝呈毛狀或較寬,分枝頂端細胞單列或多列,在同一藻體中可看到單列枝與多列枝,多列枝頂端有1～12個單列的細胞。藻體自基部到頂端細胞縱列。細胞表面觀直徑較大,方形或長方形,長20μm左右,寬30～50μm,細胞內(nèi)淀粉核2～3個,色素體充滿或不充滿,有時在同一藻體上,主干色素體不充滿,分枝色素體充滿。體厚26～70μm。切面觀細胞在單層藻體的中央。條滸苔為泛暖溫帶性海藻,多生長于中潮帶、內(nèi)灣泥底、潮間帶洼地中。

(4)扁滸苔(E.com pressa)藻體亮綠色,藻體長可達50 cm。藻體有許多分枝,基部分枝較密,上部較疏。分枝基部略為縊縮,上部較粗大,分枝的形狀和直徑與主干相似,藻體上部扁壓。藻體除基部外,細胞不排成縱列。細胞表面觀直徑10～27μm,細胞圓形至多角形,細胞壁薄,細胞內(nèi)有1個淀粉核,色素體不充滿。藻體厚8～20μm。切面觀細胞在單層藻體的中央。扁滸苔為泛暖溫帶性海藻,多生長于中、低潮帶的石礫、巖石或石沼中。

(5)管滸苔(E.tubulosa)藻體深綠色,藻體長度6～18 cm,細長單條,偶爾在基部有小分枝。藻體下部管狀或近似圓柱形,上部有時略為扁壓,自基部到頂端細胞整齊縱列,有時呈橫列。細胞表面觀直徑11～15μm,方形或長方形,細胞內(nèi)有1個淀粉核,色素體不充滿。藻體厚23μm左右。切面觀細胞在單層藻體的中央。管滸苔為泛亞熱帶性海藻,多見于內(nèi)灣,特別是半咸水,生長于潮間帶的石礫、巖石或各類物體上。

(6)曲滸苔(E.f lexuosa)藻體單條,圓柱狀或管狀,藻體長2 cm以上,有明顯的柄部,向上逐漸膨脹如腸形。細胞長13～17μm,寬10～17μm,多角形,角圓,少數(shù)長方形,排成縱列,細胞壁厚,細胞內(nèi)有1個淀粉核,色素體充滿。藻體厚20～24μm。切面觀細胞在單層藻體的中央或靠外側(cè)。曲滸苔為泛亞熱帶性海藻,多生長于高、中潮間帶的巖石或石沼中。

(7)緣管滸苔(E.linza),也稱長石莼。藻體綠色,簇生.細長單條,體長為5～30 cm,體寬為0.2～3 cm,體厚約為50μm。藻體不分枝或自基部分裂出形態(tài)相同的分枝,藻體基部狹窄細長,中部漸寬,呈帶狀,藻體表面細胞正方形、長方形或多邊形,細胞排列成縱列。自基部到頂端細胞整齊縱列,切面觀,藻體中央呈2層結(jié)構(gòu),邊緣部中空。

3.2 滸苔屬和石莼屬海藻的分類學(xué)探討

滸苔屬和石莼屬海藻作為石莼科的分類階元具有同形世代交替,孢子生殖、配子生殖和營養(yǎng)繁殖等共性特征。其屬間鑒定主要是根據(jù)藻體是否中空(即管狀或葉狀)或成體細胞層數(shù)進行區(qū)分;屬內(nèi)的不同物種,則根據(jù)藻體藻體分枝數(shù)量或葉片是否分裂、細胞直徑和排列方式、細胞內(nèi)淀粉核數(shù)量等進行鑒別。

由于在不同環(huán)境條件下,石莼科海藻藻體形態(tài)及結(jié)構(gòu)存在著廣泛的變異,因此對其系統(tǒng)分類一直存在較多的爭議。尤其是近年來,根據(jù)石莼科海藻的分子系統(tǒng)學(xué)研究的結(jié)果顯示,以ITS序列和rbc L基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹,滸苔屬和石莼屬海藻相互交錯分布,因此,有人認為應(yīng)把這2個屬的海藻都合并在石莼屬中[6-8]。但根據(jù)劉振宇等對孔石莼、U.arasakii和滸苔的質(zhì)體藍素氨基酸序列系統(tǒng)進化關(guān)系的研究結(jié)果來看,滸苔親緣關(guān)系還是要遠于原為石莼屬的2種海藻[9]。

緣管滸苔形態(tài)結(jié)構(gòu)和分子鑒定結(jié)果則進一步加強了滸苔屬和石莼屬之間的聯(lián)系。緣管滸苔藻體基部和邊緣呈中空管狀,由單層細胞構(gòu)成,類似滸苔屬海藻;藻體的其余部分無管狀結(jié)構(gòu),形成了由2層細胞構(gòu)成的藻體,與石莼屬海藻相近。1753年,Linnaeus最早發(fā)現(xiàn)該種時,將其定名為長石莼(U.linza L innaeus),其后瑞典分類學(xué)家Agardh(1883)根據(jù)特征將其轉(zhuǎn)入到滸苔屬內(nèi),命名為緣管滸苔[E.linza(Linnaeus)J Agardh],2種觀點在很長一段時間同時存在,如Levring等許多學(xué)者同意Linnaeus命名為長石莼的意見,但也有不少學(xué)者認同Agardh將其分類到滸苔屬的觀點[10-12]。

3.3 滸苔屬和石莼屬海藻的分子進化

生物進化內(nèi)在動力是基因變異,通過比對分析石莼科海藻的基因序列,可以探討其在分子水平的進化差異,驗證形態(tài)分類研究結(jié)果。

3.3.1 滸苔屬和石莼屬海藻ITS序列和5.8s rDNA序列的進化發(fā)育關(guān)系探討 rDNA是由轉(zhuǎn)錄單位和非轉(zhuǎn)錄單位的間隔區(qū)組成的一個重復(fù)單位,其中18,5.8和28s rDNA組成1個轉(zhuǎn)錄單元。而非轉(zhuǎn)錄單位包括3個部分(見圖4):①非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Non transcribed sequence N TS)位于rDNA相鄰重復(fù)單位之間;②外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Extra transcribed sequence,ETS)位于18s rDNA的上游(Upstream);③內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacers,ITS)包括ITS1和ITS2,分別位于18s rDNA和5.8s rDNA,5.8s rDNA和28s rDNA之間。有時將ITS1,5.8s rDNA和ITS2統(tǒng)稱為ITS區(qū)[13-14]。

圖4 真核生物rDNA一個拷貝的結(jié)構(gòu)Fig.4 Structure of a repeating unit eukaryote rDNA

由于ITS存在于高重復(fù)的核糖體DNA中,進化速度快且片段長度不大,加上協(xié)調(diào)進化使該片段在基因組不同重復(fù)單元間十分一致,因而十分適合于進行各種分子操作,已成為植物系統(tǒng)與進化研究中的重要分子標記。

滸苔屬和石莼屬的5.8s rDNA序列僅在4位點上出現(xiàn)堿基的突變,其中,第1和第4個突變位點為滸苔屬特有的變異位點,第2個突變位點為石莼屬特有的變異位點,第3個突變位點為2者共有的變異位點。分別對出現(xiàn)堿基突變的物種進行種內(nèi)的序列比對,從結(jié)果中可以得出,這些位點的突變是存在于不同物種之間的,并不是由測序的誤差或個體差異造成的。說明,這些變異位點是在物種進化中形成的,具有物種特征。但同時也反映出,這些變異的位點并非在屬這一分類階元上是完全一致的,其實質(zhì)上是不同物種在平行進化過程中對環(huán)境壓力的適應(yīng)。

在ITS序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹中,滸苔屬和石莼屬的各個物種分為2大進化枝。在第一進化枝中,石莼、孔石莼聚類在一起。在第二進化枝中,緣管滸苔、滸苔和裂片石莼、網(wǎng)石莼分別聚類在一起。從2個進化枝中的物種組成可以看出,滸苔屬和石莼屬的物種并沒有完全的按照各自的屬分別聚類在一起,而是交叉的分布在2個進化枝中。

ITS序列系統(tǒng)進化聚類以及5.8s rDNA序列比對結(jié)果說明,利用上述序列差異無法進一步將這2個屬海藻明確地進行鑒別,同時,以ITS和5.8s rDNA序列進行緣管滸苔和滸苔,裂片石莼和網(wǎng)石莼鑒定時,其堿基位點差異極小或相同,因此在研究過程中需要加大測序的樣本數(shù)量以保證測序和拼接結(jié)果的準確性。

3.3.2 滸苔屬和石莼屬海藻rbc L基因序列的進化發(fā)育關(guān)系探討 核酮糖-1,5-雙磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)是葉綠體基質(zhì)中的主要可溶性蛋白,此酶在光合作用的Calvin—Benson循環(huán)中固定CO2,而且也在C3植物的光呼吸過程中起作用。它由8個相同的大亞基和8個相同的小亞基組成。大亞基由葉綠體DNA編碼并且由葉綠體的核糖體合成;小亞基由核基因編碼。首先由細胞質(zhì)內(nèi)的核糖體合成前體蛋白,穿越葉綠體膜后再加工為成熟形式[15]。編碼大亞基的基因簡稱為rbc L基因,編碼小亞基的基因簡稱為rbcS基因。

高等植物rbc L基因在結(jié)構(gòu)上和原核生物基因相似,由5’非編碼區(qū)、編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)3部分組成。5’非編碼區(qū)具有可以和葉綠體16S rRNA 3’端附近互補的SD序列;3’非編碼區(qū)具反向重復(fù)序列,能形成典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)作為轉(zhuǎn)錄終止信號;多數(shù)rbc L基因還具有和原核生物基因啟動子類似的共通序列[16-17]。

從滸苔屬和石莼屬海藻rbc L序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹中可以看出,滸苔屬和石莼屬的各個物種分為2大進化枝。此2個進化枝中的物種組成以及各個物種的分支情況都與以ITS序列為依據(jù)對滸苔屬和石莼屬建立的系統(tǒng)樹情況相似。即滸苔屬和石莼屬的物種并沒有完全的分別按照各自的屬聚類在一起,而是交叉的分布在2個進化枝中。

綜合分析滸苔屬和石莼屬海藻以rbc L和ITS序列為依據(jù)建立的系統(tǒng)樹,以rbc L和ITS序列為依據(jù),不能將滸苔屬和石莼屬中的各個物種鑒別開來;以目前發(fā)表的rbc L和ITS序列為依據(jù),現(xiàn)有分類的滸苔屬和石莼屬中的各個物種間沒有表現(xiàn)出明顯屬間的差異,且從系統(tǒng)樹中可以看出,屬間物種有明顯的交叉情況。且從rbc L和ITS序列分別聚類的結(jié)果來看,石莼和孔石莼、腸滸苔、扁滸苔都聚類到同一進化枝上,而裂片石莼和網(wǎng)石莼、滸苔和緣管滸苔也聚類到另一進化枝上。這顯示出在分子進化水平上較為一致的結(jié)果,將為滸苔屬和石莼屬系統(tǒng)分類深入研究提供一定的證據(jù)。

3.3.3 滸苔屬和石莼屬海藻質(zhì)體藍素序列的進化發(fā)育關(guān)系探討 質(zhì)體藍素(Plastocyanin)是含有銅原子的蛋白質(zhì),普遍存在于包括藍細菌、綠藻和高等植物在內(nèi)的能進行有氧光合作用的物種中,具有從光合系統(tǒng)Ⅱ傳遞電子到光合系統(tǒng)I的重要功能。質(zhì)體藍素包含近100個氨基酸殘基的多肽鏈以及I型銅離子(也稱銅藍位點);該銅離子結(jié)合在多肽鏈的4個氨基酸殘基(即2個組氨酸殘基、1個半胱氨酸殘基和1個甲硫氨酸殘基[18-20])上。

阿氏石莼、孔石莼、滸苔分為2大進化枝,其中,阿氏石莼和孔石莼在NCB I上發(fā)表的質(zhì)體藍素氨基酸序列在第1進化枝中,滸苔的質(zhì)體藍素氨基酸序列在第2進化枝中。但在第1進化枝中,孔石莼的3個質(zhì)體藍素氨基酸序列沒有完全分布在同一個分支上,P56274和1IUZ聚類在一起,并且,從比對結(jié)果中可以看到,AA T45616與前2個序列存在10個氨基酸序列的差異,這可能是因為其材料來源的不同造成的。

以目前滸苔屬和石莼屬已公布的質(zhì)體藍素氨基酸序列來看,阿氏石莼、孔石莼、滸苔的聚類結(jié)果符合現(xiàn)有的滸苔屬和石莼屬的ITS、rcb L分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果,但是,現(xiàn)有發(fā)表的滸苔屬和石莼屬的質(zhì)體藍素氨基酸序列的物種較少,尚不足以說明其是否廣泛適用于滸苔屬和石莼屬間各物種的分類鑒定。

在海藻物種的分類和鑒定方面,主要依據(jù)藻體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生殖方式、生活史類型等性狀特征進行分類,盡管不同的海藻物種所持有的這些性狀特征是遺傳基因所決定的,但其在不同海洋環(huán)境條件下顯示出了廣泛的適應(yīng)能力,表現(xiàn)為環(huán)境因素過多地影響到了表型特征。不僅在單細胞的微型藻類方面存在著巨大的爭議,即使是在大型藻類常見種鑒定方面也出現(xiàn)了一些激烈的爭議。二十世紀末期隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因測序技術(shù)快速發(fā)展,藻類分子系統(tǒng)學(xué)的研究結(jié)果往往顯示出經(jīng)典分類學(xué)上的對物種甚至屬一級定義的差異,這似乎更為充分地證實了藻類生物平行進化復(fù)雜機制。但從分子系統(tǒng)學(xué)研究手段本身而言,也存在很多需要進一步研究和探討的問題。不同類群同一DNA序列的進化速率有所差異,同一類群中不同DNA序列的進化速率也不相同,因此應(yīng)針對不同分類階元選取相應(yīng)的DNA序列;生物進化實質(zhì)上是基因組的進化,因此,少數(shù)基因片段無法全面、準確地描述在物種水平上的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和反映其演化歷史。藻類具有核、線粒體和葉綠體3套基因組,從多個層次以及多個基因位點上系統(tǒng)地研究藻類形態(tài)結(jié)構(gòu)進化、生態(tài)適應(yīng)以及基因進化的內(nèi)在關(guān)系則顯得更為重要和迫切。

致謝:本文石莼屬和滸苔屬形態(tài)分類部分惠承中國科學(xué)院海洋研究所丁蘭平研究員審訂。

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Biological Characteristics and Molecular Systematics Studies on Common Green Algae of Ulvaceae

L IU Yan1,L IU Tao1,YU Dan2,ZHANG Jing1,WANG Xu-M in2,GONG Qing-Li1
(1.College o f Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.Beijing Genomics Institute of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100029,China)

Biological research and species identification is one of the hotspo ts and difficulties of green tides study.This paper describes the biological characteristicsof common green algae of U lvaceae and discusses the difficulties of systemic classification.ITS sequences,rbc L sequences and p lastocyanin amino acid sequences were used to analyze the molecular systematics of 10 green algae of Ulvaceae.Studies show ed that rbcL and ITS sequences between Ulva and Enteromorpha didnot reflect intergeneric differentiation.According to the phylogentic trees constructed respectively by rbc L sequences and ITS sequences,U lva lactuca,U lva pertusa,Enteromorpha intestinalis and Enteromorpha com pressa were clustered to the same evolutionary branch and Ulva fasciata,Ulva reticu lata,Enteromorpha prolifera and Enteromorpha linza were clustered to another,indicating consistent results at the molecular evolutionary level.It also p rovided evidence for further research between U lva and Enteromorpha.According to the phylogentic tree constructed by p lastocyanin am ino acid sequences,the sequence of U lva arasakii and the sequences of U lva pertusa were clustered to the first evolutionary branch and the sequences of Enterom orpha prolifera were clustered to the second.Three sequences of U lva pertusa were clustered to different evolutionary branches.

Ulva;Enteromorpha;classification;ITS;rbcL

Q944

A

1672-5174(2010)12-071-10

青島市科技項目(09-2-5-5-hy);國家科技支撐計劃項目(2008BAC49B01)資助

2009-10-26;

2010-01-10

劉 巖(1979-),女,講師,博士生,研究方向為藻類學(xué)。Tel:0532-82032377;E-mail:qd_liuyan@ouc.edu.cn

**通訊作者:gongqingli@vip.sina.com

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