黑籽南瓜離體再生體系與轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究

李長生　趙傳志　李愛芹　夏　晗

摘要：以黑籽南瓜為試驗(yàn)材料，子葉為外植體，建立了黑籽南瓜組織培養(yǎng)再生體系，并對轉(zhuǎn)基因常用的抗生素濃度進(jìn)行了篩選。試驗(yàn)結(jié)果表明：萌發(fā)4天的子葉是誘導(dǎo)芽再生的最佳外植體，MS+1.0mg／L BA是誘導(dǎo)芽再生的最適培養(yǎng)基，1／2MS+0.5mg／L GA₃是適合再生苗壯苗和生根的培養(yǎng)基。100mg／L卡那霉素、50ms／L潮霉素適于南瓜的轉(zhuǎn)基因，初步的轉(zhuǎn)基因研究驗(yàn)證了此轉(zhuǎn)化體系的有效性。

關(guān)鍵詞：黑籽南瓜；組織培養(yǎng)；轉(zhuǎn)基因

中圖分類號：S642.903.6文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942(2009)07-0008-04

黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia Bouche，)屬于葫蘆科南瓜屬。栽培南瓜及其野生近緣種均起源于美洲，廣泛分布于世界各地，我國栽培的南瓜屬植物主要有美洲南瓜、印度南瓜和中國南瓜。南瓜屬植物不僅是重要的蔬菜來源，還具有保健和觀賞作用。黑籽南瓜是南瓜屬中種子為黑色的栽培種，染色體數(shù)2n=2x=40，起源于中美洲的高原，現(xiàn)分布于墨西哥中部、中美洲至南美洲智利的廣大地區(qū)，果實(shí)產(chǎn)量高，是優(yōu)良的飼料。黑籽南瓜生長勢強(qiáng)，生長要求溫度低，其根系在較低的地溫下伸長能力強(qiáng)，發(fā)育良好，對葫蘆科蔬菜枯萎病抗性強(qiáng)，嫁接親和性好，是嫁接黃瓜的常用砧木。

雖然黑籽南瓜作為砧木能夠在很大程度上減少土傳病害，但隨著保護(hù)地面積的擴(kuò)大，規(guī)?；N植和連作的加重，土傳病害(如黃瓜枯萎病、疫病等)的變種激增，新病害不斷出現(xiàn)，防治難度加大。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前大棚土傳病害已上升為主要病害。對壽光市170棟大棚蔬菜隨機(jī)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，土傳病害發(fā)生嚴(yán)重的占73.2％，其中根結(jié)線蟲發(fā)生嚴(yán)重和較嚴(yán)重的占42.5％；對濟(jì)源市2500棟溫棚蔬菜調(diào)查顯示，每年都發(fā)生土傳病害的占95％，其中根結(jié)線蟲占35％；中等程度發(fā)生的占52.5％，嚴(yán)重發(fā)生的占23.4％。目前我國設(shè)施蔬菜病害仍以化學(xué)防治為主，過量、頻繁施用化學(xué)殺菌劑的現(xiàn)象普遍存在，對土壤環(huán)境危害嚴(yán)重。近年來，生物工程方法在作物病害防治領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，并取得了良好的效果，利用轉(zhuǎn)基因方法將抗病基因轉(zhuǎn)入黑籽南瓜，既能提高其抗病性，又不會將外源基因轉(zhuǎn)入黃瓜。穩(wěn)定的離體再生和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是基因改良黑籽南瓜品種的前提，雖然南瓜的組培體系已有報道，但其再生頻率仍然較低，且不同南瓜栽培種的離體再生條件不盡相同。本研究以砧木用黑籽南瓜子葉為外植體，對影響其再生的激素種類及其濃度進(jìn)行篩選，并在此基礎(chǔ)上將帶有潮霉素抗性標(biāo)記的植物表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入黑籽南瓜，對利用轉(zhuǎn)基因方法改造黑籽南瓜的抗病性做了有益探索。

1材料與方法

1.1材料

挑選飽滿的黑籽南瓜種子，蒸餾水中浸泡30min，剝?nèi)シN皮，70％乙醇滅菌30s，無菌水沖洗2次，2.5％次氯酸鈉滅菌15min，無菌水沖洗3次以上，在無激素的1／2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(26±2)℃，培養(yǎng)3～8d，以發(fā)芽的種子制備外植體。

1.2方法

1.2.1黑籽南瓜離體再生體系的建立以MS為芽再生的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，NAA設(shè)0、0.02、0.05、0.1mg／L四個濃度，BA設(shè)0.5、1、4 mg／L三個濃度，篩選最合適芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。以1／2MS為再生芽生根的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配合NAA和GA₃，篩選最適合根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

1.2.2黑籽南瓜外植體對常用轉(zhuǎn)基因標(biāo)記抗生素濃度敏感性篩選對常用的轉(zhuǎn)基因再生苗抗生素篩選標(biāo)記進(jìn)行外植體敏感性試驗(yàn)，篩選適宜的抗生素濃度，其中卡那霉素設(shè)50、100、150mg／L三個濃度，潮霉素設(shè)20、30、50、80mg／L四個濃度，添加到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，觀察芽再生情況和外植體的反應(yīng)。

1.2.3黑籽南瓜轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系將帶有潮霉素抗性篩選標(biāo)記的植物表達(dá)載體pCAMBIA1381z轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株C58C1，子葉在過夜培養(yǎng)的農(nóng)桿菌中浸泡10min，用無菌濾紙除去多余菌液，將子葉置于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2天，外植體轉(zhuǎn)移到添加30mg／L潮霉素和200mg／L頭孢霉素的芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上。潮霉素抗性再生苗經(jīng)壯苗和生根后，取葉片提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測潮霉素抗性基因。

2結(jié)果與分析

2.1黑籽南瓜外植體離體再生情況

取萌發(fā)3～7天的無菌子葉，從葉柄處切斷，將子葉橫向一分為二，置于分化培養(yǎng)基上，10天后子葉膨大，在傷口處出現(xiàn)愈傷組織(圖1A)；20天后在愈傷組織附近出現(xiàn)再生芽(圖1B)或再生根。在萌發(fā)3～7天的子葉中，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)4天剛剛開始變綠的子葉分化能力最強(qiáng)，出愈率達(dá)到100％，芽分化率達(dá)到60％以上，而其它發(fā)育時期子葉外植體芽分化率在40％以下。對外植體愈傷組織發(fā)生位置的觀察發(fā)現(xiàn)，子葉切口處均有愈傷組織，但只有靠近葉柄處的愈傷組織能夠再生出芽，故在后續(xù)試驗(yàn)中采用萌發(fā)4天的子葉作為外植體，外植體切割時留有小段葉柄。

2.2黑籽南瓜離體再生體系的建立

由表1可看出，在MS基本培養(yǎng)基上，當(dāng)BA濃度為1.0mg／L時，隨著NAA濃度的增大，黑籽南瓜子葉再生芽頻率呈逐漸降低趨勢，且不添加NAA的處理其不定芽再生率最高(66.7％)；當(dāng)BA的濃度大于或小于1.0mg／L時，黑籽南瓜不定芽再生率均為0。可見，最適合黑籽南瓜芽再生的培養(yǎng)基為MS+1.0mg／LBA。

另外，試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，適合黑籽南瓜再生苗生長的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1／2MS培養(yǎng)基，最適合其根誘導(dǎo)和壯苗的培養(yǎng)基為1／2MS+0.5mg／LGA₃，再生苗可以在不添加生長素類激素的1／2MS培養(yǎng)基上正常生根(圖1C)。

2.3常用抗生素對黑籽南瓜外植體再生的影響

選用轉(zhuǎn)基因常用的潮霉素、卡那霉素，觀察不同抗生素對黑籽南瓜外植體植株再生的影響。結(jié)果(表2)表明，在添加20、30mg／L潮霉素或添加50mg／L卡那霉素的分化培養(yǎng)基上，大部分外植體可以形成愈傷組織，出愈率達(dá)到90％以上；在50mg／L潮霉素或100mg／L卡那霉素的培養(yǎng)基上，外植體出愈率降低，少數(shù)外植體分化出黃化再生芽；在80mg／L潮霉素或150mg／L卡那霉素的培養(yǎng)基上，個別外植體能形成愈傷組織，大部分外植體在培養(yǎng)2周后枯萎死亡。可見，可選用50mg／L的潮霉素和100mg／L卡那霉素作為黑籽南瓜轉(zhuǎn)基因篩選的高限臨界濃度。

2.4黑籽南瓜轉(zhuǎn)基因體系的建立

采用以上篩選出的再生體系作為黑籽南瓜轉(zhuǎn)基因的基礎(chǔ)。將帶有潮霉素抗性篩選標(biāo)記的植物表達(dá)載體pCAMBIA1381z，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58C1，侵染外植體，在分化培養(yǎng)基上以50mg／L的潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因植株，以200mg／L的頭孢霉素作為抑菌素，培養(yǎng)20天后，分化出再生芽。再生芽長到1cm時轉(zhuǎn)入壯苗和生根培養(yǎng)基，2周后在幼苗上剪取葉片提取DNA，用潮霉素抗性基因引物檢測轉(zhuǎn)基因植株。9株再生苗中，陽性為2株，弱陽性5株(圖2)。

3討論

與其它植物一樣，南瓜屬植物也可以通過胚狀體和器官發(fā)生兩種途徑進(jìn)行離體再生，但南瓜屬植物種和品種的多樣性使得其離體再生的條件差異較大，但目前南瓜的離體再生多采用子葉為外植體。本試驗(yàn)結(jié)果表明，黑籽南瓜不同苗齡的子葉分化能力也不相同，以萌發(fā)4天，顏色開始變綠的子葉分化能力最強(qiáng)，這與其他研究者的結(jié)論相同。這可能是由于南瓜子葉在種子萌發(fā)過程中內(nèi)源激素濃度變化顯著，而外植體內(nèi)源激素濃度和比例與其分化能力密切相關(guān)。

有研究表明，中國南瓜誘導(dǎo)再生芽的過程需要BA的作用，但0.5-2mg／L的BA對其芽的誘導(dǎo)沒有很大區(qū)別，黃狼南瓜和錦粟2號南瓜的芽誘導(dǎo)和根誘導(dǎo)過程則需要分裂素和生長素的共同作用。本研究發(fā)現(xiàn)，黑籽南瓜誘導(dǎo)再生芽的最適培養(yǎng)基為MS+1.0mg／LBA，不需要NAA等生長素的配合，在子葉分化芽的過程中常常伴有根的分化，或只分化出根，說明外植體內(nèi)源生長素積累較多，需要外加分裂素調(diào)節(jié)誘導(dǎo)芽的再生。同樣，在壯苗及生根培養(yǎng)基中也不需要生長素的配合，GA₃在培養(yǎng)后期起到促進(jìn)芽伸長的作用。初步轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)表明，此再生和轉(zhuǎn)基因體系為基因工程改良黑籽南瓜種質(zhì)打下了基礎(chǔ)。