3種精子優(yōu)化處理方法處理精液效果評(píng)價(jià)

鄧俊耀 張朝暉 秦英鍵

摘要: 目的:為了解上游法?Percoll梯度離心法?Isolate密度梯度離心法等精子優(yōu)化處理方 法處理精液的效果。方法:選取120例女性原因引起繼發(fā)不孕的夫婦,將男方的精液 標(biāo) 本按處理方法不同隨機(jī)分4組,即為上游組?Percoll組?Isolate組和對(duì)照組,應(yīng)用指標(biāo)精 子密度?a+b級(jí)活力?正常形態(tài)率和綠色熒光精子百分率,對(duì)精液處理后的效果進(jìn)行比較。 結(jié)果:上游組?Percoll組和Isolate組,富集的精子a+b級(jí)活力?正常形態(tài)率?綠色熒光精 子明顯高于對(duì)照組(P<0.01),Percoll組和Isolate組的精子密度與對(duì)照組無(wú)明顯差異 (P> 0.05),但上游組的精子密度很明顯低于對(duì)照組(P<0.01);上游組?Percoll組及I sola te組之間比較,富集的精子a+b級(jí)活力?正常形態(tài)率沒(méi)有明顯差異(P>0.05),但精子 回收 Percoll密度梯度離心法和Isolate密度梯度離心法明顯高于上游法(P<0.01),Isolat e密 度梯度離心法富集綠色熒光精子最多,上游法次之,Percoll密度梯度離心法最低。結(jié)論: Isolate密度梯度離心法處理精液效果較好。

關(guān)鍵詞:精子;優(yōu)化;評(píng)價(jià)

中圖分類(lèi)號(hào): R715 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A 文章編號(hào): 1008-2409(2009)05-0832-03

Evaluation on the effect of semen processed with three semen optimized methods/D ENG Jun-yao, ZHANG Chao hui, QIN Ying jian∥Laboratory of Reproductive MedicalCenter, Hospital of Guilin Women and Children, Guilin 541000, China

Abstract: Objective: To investigate the effect of semen processedwith Swim up m ethod,Percoll gradient centrifugation method, Isolate density gradient centrifug ation method. Methods: 120 cases of female seco ndary infertility in couples were investigated. The male's semen specimens by th e different treatme nt method were randomly divided into four groups,they were Swim up group, Percol l group, Isolate group and the control group. The parameter s with semen conventional analysis and the percentage of green fluorescent spermwith AO Fluorescence staining were compared. Results: Swim up group, Percoll g roup and Isolat e group concentrated sperm with the a + b class dynamic, the rate of normal formand the rate of green fluorescent sperm were significantly higher than that ofthe con trol group(P<0.01). The sperm density showed no obvious difference in Per coll group a nd Isolate group compared with the control group(P>0.05). However, the sper m de nsity of Swim up group was significantly lower than that of the control group( P<0.01) ,the sperm a + b class dynamic and the rate of normal form showed no obvious di fferen ce between Swim up group and Percoll group and Isolate group(P>0.05). Ho weve r, the sperm density of Percoll group and Isolate group was significantly higherthan that of Swim up group(P<0.01). The rate of green fluorescent spermof Isolate gro up was the highest among Swim up group, Percoll group and Isolate group. Conclusion: T heeffect of semen processed with Isolate density gradient centrifugation method w as better in three methods.

Key words: sperm; optimization; evaluation

精子優(yōu)化處理是輔助生殖技術(shù)治療中的常規(guī)步驟,目的是富集足夠數(shù)量具有高活力?正常形 態(tài)和正常功能的精子。常用于精子優(yōu)化處理方法有上游法?Percoll梯度離心法?Isolate密 度梯度離心法等,為了選擇比較適合于輔助生殖技術(shù)治療的精液處理方法,筆者對(duì)這3種優(yōu) 化處理方法處理精液后的效果進(jìn)行了評(píng)價(jià),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象和標(biāo)本采集

標(biāo)本選自2008年6~12月份,120例女性原因引起繼發(fā)不孕的夫 婦,男方年齡在24~40歲,禁欲3~5d,用手淫法取精,將精液收集入無(wú)菌無(wú)毒容器內(nèi),置 37℃(5%CO2)培養(yǎng)箱內(nèi)液化。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

無(wú)菌操作臺(tái)(蘇州佳寶凈化公司),TDL-5Z-B型離心機(jī)(湖南星科公司),普 通 顯微鏡和熒光顯微鏡(日本OLYMPUS);洗精液(ART-1006),平衡液(ART-1020),Isolat e精 子分離液(40%,80%二氧化硅膠體液組成上?下層,美國(guó)IrvineScientific公司),Percoll 精子分離液(40%,80%聚乙烯吡咯烷酮液組成上?下層, 上海晶天生物科技有限公司),吖啶 橙(AO)熒光染液100ml(自配:0.06g/L吖啶橙,37mmol/L 枸櫞酸,126mmol/L Na2HPO4 ;1mmol/L EDTA,0.15mol/L NaCl,pH6.0)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

對(duì)120例標(biāo)本隨機(jī)分為4組,每組30例,對(duì)照組(不做特殊處理),上游組( 即上游法處理組),Percoll組(即Percoll密度梯度離心法處理組),Isolate組(即Isola te密度梯度離心法處理組)。

1.4 精子處理方法

①上游法:取液化精液2ml與4ml洗精液(ART-1006)混勻,300g離心15min ,留管底精子團(tuán),再用2ml洗精液(ART-1006)混勻,300g離心10min,去除上清液后,留底 部沉 淀精子,加入1.0ml平衡液(ART-1020),傾斜45度角,置CO2培養(yǎng)箱孵育45min,待精子充 分上游后, 吸取上層含精子的懸液0.5ml于無(wú)菌試管中。②Isolate密度梯度離心法:取2.0ml 40% Is olate(上層)加入錐形離心管內(nèi),然后用無(wú)菌巴斯德吸管垂直沿管底緩慢加入2.0ml 80% Isol ate(下層),使兩液層交界處可見(jiàn)清晰分界面,最上層加入待處理精液2.0ml,離心和精子收集 與上游法相同。③Percoll梯度離心法:離心管底層加含80% Percoll,中層加含40% Percoll, 上層加入2.0ml精液,方法同Isolate法。

1.5 精液分析方法

將已處理后的精子懸液(對(duì)照組取精子原液)充分混勻,采用WHO推薦的 精液常規(guī)分析標(biāo)準(zhǔn)方法[1]進(jìn)行精液分析,主要觀察指標(biāo)精子密度?a+b級(jí)活力?正 常形態(tài)率。

1.6 AO熒光染色方法

取已處理后的精子懸液(對(duì)照組取精子原液)10μl于載玻片上制成薄 層精液膜,無(wú)水乙醇固定30min,干燥后加AO染液3滴,染色10min,熒光顯微鏡490nm觀察500條 精子。由于AO與結(jié)構(gòu)完整的雙股DNA結(jié)合發(fā)綠色熒光,則與去螺旋化或變性斷裂的單股DNA結(jié) 合呈紅色,正在變性的DNA顯黃光或橙光,計(jì)數(shù)綠色熒光精子百分率(下稱(chēng)綠色熒光精子率 )。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),用方差和q值進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

對(duì)照組與3處理組精子密度?a+b級(jí)活力?正常形態(tài)率及綠色熒光精子率的結(jié)果見(jiàn)表 1。

3 討論

常規(guī)的精液分析能夠從精子密度?精子活力和精子形態(tài)等方面反映精液處理后的質(zhì)量,但是 其在精子功能的評(píng)價(jià)方面價(jià)值是有限的,不能直接反映精子受精能力和對(duì)胚胎發(fā)育的影響。 近年來(lái)的研究表明精子DNA的完整性與精子活力?精子形態(tài)及精子功能有顯著相關(guān)性,并且 精子DNA損傷可以影響受精比率?胚細(xì)胞發(fā)育和妊娠概率[2],因此,本次評(píng)價(jià)優(yōu)化 處理法處 理精液的效果除了用精液常規(guī)外,還增加了能反┯塵子狣NA損傷情況的AO熒光染色法。 上游 組?Percoll組和Isolate組與對(duì)照組比較,處理后的精子的a+b級(jí)活力?正常形態(tài)率?綠色 熒光精子率均明顯增加,說(shuō)明3種精子優(yōu)化處理法富集高活力?正常形態(tài)和正常功能的精子 有明顯效果;Percoll組和Isolate組的精子密度與對(duì)照組無(wú)明顯差異,但上游組的精子密度 很明顯低于對(duì)照組,這提示上游法不能用于精子少或弱的精液處理。上游組?Percoll組和I solate組3組之間相互比較中,3組富集的精子的a+b級(jí)活力?正常形態(tài)率無(wú)明顯差別,Per coll組和Isolate組的精子密度也無(wú)明顯差異,但Percoll組和Isolate組的精子密度明顯高 于 上游組,說(shuō)明Percoll密度梯度離心法和Isolate密度梯度離心法處理精液回收精子優(yōu)于上游 法;而綠色熒光精子率各組之間都有明顯差異,其中Isolate組相對(duì)最高,上游組相對(duì)次之 ,Percoll組相對(duì)最低,也就是說(shuō)對(duì)精子DNA的損傷情況,Isolate密度梯度離心法相對(duì)最低 ,上游法相對(duì)次之,Percoll密度梯度離心法相對(duì)最高。Isolate密度梯度離心法處理精液一 方面可能是Isolate精子分離液是一種非連續(xù)液態(tài)過(guò)濾膜,為二氧化硅以共價(jià)鍵形式交錯(cuò)聯(lián) 結(jié)于Hepes-HTF,是經(jīng)特殊處理的懸浮膠體密度梯度介質(zhì),可有效減少細(xì)胞污染,與待分離 精子不發(fā)生反應(yīng),不易使頂體膜蛋白失活[3],具有保護(hù)精子DNA結(jié)構(gòu)免受損傷作用 ,另一方 面可能是Isolate所含有的二氧化硅膠體兼作支持體與分子篩的作用[4],對(duì)離心力 有緩沖作 用,使對(duì)精子潛在的氧化損傷降至最低;上游法處理精液可能是去除了精漿,由于精漿含有 具有保護(hù)精子功能的主要抗氧化物質(zhì),隨著精漿的去除會(huì)造成精子的氧化應(yīng)激損傷,增加DN A斷裂概率[5],加之精子在培養(yǎng)液中離心,由于人精子頂體部含有大量不飽和脂肪 酸,并且 缺乏抗氧化機(jī)制,處理精液時(shí)較大的離心力可增加精子產(chǎn)生過(guò)多氧自由基(ROS)而損傷精子功 能,特別是促使精子的DNA 的氧化變性[6,7]。Percoll密度梯度離心法處理精液, 除了上游 法所提到的可造成精子DNA損傷因素外,還可能有由于Percoll中含有聚乙烯吡咯烷酮在離心 過(guò)程中可加速精子膜過(guò)氧化反應(yīng)導(dǎo)致DNA完好性受損[7]的因素。由此可以看出,造 成精子D NA損傷的因素,Percoll密度梯度離心法相對(duì)最多,上游法相對(duì)次之,Isolate密度梯度離心 法相對(duì)最少,對(duì)精子DNA的損傷情況,理應(yīng)是Isolate密度梯度離心法相對(duì)最低,上游法相對(duì) 次之,Percoll密度梯度離心法相對(duì)最高。由于Isolate密度梯度離心法處理后精子DNA損傷 最小,其精子密度?a+b級(jí)活力及正常形態(tài)率均能達(dá)到輔助生殖技術(shù)治療要求,因此,筆者 認(rèn)為Isolate密度梯度離心法處理精液效果較好,在輔助生殖技術(shù)治療中選擇該法處理精液 比較適合。

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(收稿日期: 2009-05-02)

[責(zé)任編輯 王慧瑾 鄧德靈]