mIκBα表達載體在大鼠肝星狀細胞中的穩(wěn)定表達

楊友誼 鄒偉敏

(湖北中醫(yī)藥高等專科學校，湖北 荊州 434020) (荊州區(qū)東城社區(qū)衛(wèi)生服務中心，湖北 荊州 434020)

mIκBα表達載體在大鼠肝星狀細胞中的穩(wěn)定表達

楊友誼 鄒偉敏

(湖北中醫(yī)藥高等專科學校，湖北 荊州 434020) (荊州區(qū)東城社區(qū)衛(wèi)生服務中心，湖北 荊州 434020)

目的：探討將mIκBα基因成功轉(zhuǎn)染入大鼠肝星狀細胞，并在其中穩(wěn)定表達。方法：應用脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將mIκBα基因真核表達載體pCMX-mIκBα導入大鼠肝星狀細胞中，采用G418篩選途徑得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的大鼠肝星狀細胞，再通過Western blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后大鼠肝形狀細胞中相應mIκBα蛋白表達水平。結(jié)果：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的大鼠肝星狀細胞中證實有pCMX-mIκBα相應蛋白質(zhì)的表達。結(jié)論：mIκBα基因真核表達載體pCMX-mIκBα成功轉(zhuǎn)入大鼠肝星狀細胞，并在細胞中得到穩(wěn)定表達，為進一步研究NFκB和肝星狀細胞凋亡之間的關(guān)系，并為通過誘導肝星狀細胞凋亡治療肝纖維化尋找實驗及理論基礎。

肝星狀細胞；核轉(zhuǎn)錄因子突變體；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB/IκB系統(tǒng)因其在機體各生物過程的調(diào)控中所起的重要作用已越來越引起人們的廣泛重視。NF-κB能調(diào)控細胞在應急、感染、炎癥等情況下的基因表達。參與細胞增殖、凋亡及細胞免疫反應的調(diào)控。最引人注目的是，它在腫瘤細胞的抗凋亡機制中起著關(guān)鍵作用。IκBα是NF-κB最重要的調(diào)控因子。靜息狀態(tài)下，NF-κB與IκBα相結(jié)合而存在于細胞漿中，當受到外界因素刺激時，IκBα被磷酸化并迅速降解，使NF-κB釋放并活化而進入細胞核，從而調(diào)控一系列基因的表達。研究表明，第32和第36位絲氨酸在IκBα的降解中起著至關(guān)重要的作用，S32、S36發(fā)生突變的mIκBα不會被降解，與NF-κB發(fā)生不可逆結(jié)合而抑制其激活。這種現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使人們可能找到了一條調(diào)控NF-κB活性進而調(diào)控一系列生物學過程的有效方法。本實驗旨在通過轉(zhuǎn)染技術(shù)把mIκBα導入大鼠肝星狀細胞中，并篩選獲得mIκBα穩(wěn)定表達株。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SD大鼠由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，體質(zhì)量200～350g。

1.1.2試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基(Gibco-BRL公司產(chǎn)品)、G418(Gibco-BRL公司產(chǎn)品)、大量質(zhì)粒制備試劑盒(Wazard大量DNA純化系統(tǒng)為Promega公司產(chǎn)品)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(Lipofectamine2000為Invitrogene公司產(chǎn)品)、LB培養(yǎng)基、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ HindⅢ TaqDNA聚合酶 T4DNA連接酶(均為MBI公司產(chǎn)品)、markerⅣ(天根生化科技有限公司)、1mol/L CaCl2。E.coli(DH5)(寶生物工程大連有限公司)。mIκBα基因真核表達載體：pCMX-mIκBα(Santa Cruz公司)。

二氧化碳培養(yǎng)箱(Forma Scientific 公司)、超凈工作臺(蘇州凈化設備公司)、臺式高速低溫離心機(GS-15R美國Beckman公司)、基因擴增儀(PE9600美國PE公司)、紫外可見分光光度計(DU650美國Beckman公司)。

1.2方法

1.2.1肝星狀細胞分離培養(yǎng) SD大鼠，采用肝離體膠原酶和鏈霉蛋白酶灌注消化,50g低速離心去除肝細胞,密度梯度分離HSC,采用臺盼藍染色排斥法鑒定細胞活率，Desimin加α-SMA免疫細胞化學染色法鑒定HSC純度。取上述方法獲得的大鼠HSC采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%

CO2環(huán)境中體外傳代培養(yǎng)。

1.2.2質(zhì)粒的制備 感受態(tài)細胞的制備: 取-70℃存儲的大腸桿菌JM103菌種，用白金絲接種環(huán)直接蘸取菌液。在LB瓊脂平板(不含抗菌素)上劃線，37℃培養(yǎng)過夜；從平板上挑取一個單菌落，接入含2mlLB培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜；取0.2ml上述菌液，轉(zhuǎn)入含30ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)2.5h；將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入40ml的離心管中，置冰上10min，然后于2 500r/min、4℃離心10min；棄上清，將細菌重新懸浮于100mmol/L氯化鈣25ml中，冰浴20min后，2 500r/min、4℃離心10min；棄上清，將細菌重新懸浮于1ml 100mmol/L氯化鈣中過夜。

轉(zhuǎn)化：取5μl連接產(chǎn)物加至100μl感受態(tài)細胞中，水浴30min，轉(zhuǎn)入42℃熱休克60～90s，立即置于冰上2min；加入800μl LB(Amp-)培養(yǎng)液，37℃ 2 000rpm振搖60min，去20μl菌液于事先制備好的Amp+ LB平板上，用無菌玻璃棒將溶液均勻涂布與整個平皿表面，置37℃溫育過夜。

重組體的篩選和鑒定：挑取單菌落接種到3ml含氨芐青霉素(50μl/ml)的LB培養(yǎng)基中；37℃振搖過夜(12～16h)，離心收集細菌；加入溶液Ⅰ100μl(50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris-HCl pH8.0、10mmol/L EDTA pH8.0)，混勻，室溫放置5min；加200μl新鮮配制的溶液Ⅱ(1%SDS，0.2mol/L NaOH)，顛倒混勻，冰浴5min；加150μl的溶液Ⅲ(3mmol/L Kac，2mmol/L Hac，pH4.8)，顛倒混勻，冰浴10min；15 000rpm離心5min；上清液用酚/氯仿和氯仿各抽提一次；取上層水相加入2倍體積的無水乙醇，5 000rpm離心15min；棄上清，沉淀于室溫干燥后，溶于20μl TE中，儲存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

質(zhì)粒內(nèi)切酶分析鑒定：內(nèi)切酶分析參照說明書進行，依次在EP管中加入質(zhì)粒DNA、10×緩沖液、內(nèi)切酶BamHⅠ與BamHⅢ，用滅菌去離子水補至總體積20μl,37℃水浴2～3h，然后加樣于1%瓊脂凝膠進行電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.3基因轉(zhuǎn)染 收獲處于對數(shù)生長期的大鼠肝星狀細胞，以5×104個細胞/孔轉(zhuǎn)種于12孔的培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24h，細胞長至80%融合；棄去細胞培養(yǎng)基，并用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞兩次備轉(zhuǎn)染用；每孔細胞加入200μl溶液Ⅲ，前后輕微搖晃培養(yǎng)板，并同時用Puc119空質(zhì)粒作陰性對照；37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)6h后加入1 000μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，不棄去轉(zhuǎn)染液。

1.2.4G418篩選 轉(zhuǎn)染后經(jīng)24h，待細胞生長接近完全融合時以1：10密度傳代于含300μg/ml G418的篩選培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，同時用不加轉(zhuǎn)染液的細胞作為對照；當對照組細胞大部分死亡時，更換一次篩選培養(yǎng)基，G418濃度降低至150μg/ml以維持篩選用，繼續(xù)培養(yǎng)；約3～4周后，可見抗性克隆形成，待其逐漸增大后，逐一轉(zhuǎn)入50ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2.5mIκBα蛋白的檢測(Western blot) 細胞蛋白質(zhì)提?。哼x用生長良好的細胞，用預冷至4℃的PBS緩沖液漂洗細胞2次，棄去洗液并吸取殘余的PBS液體，加入0.5ml裂解緩沖液置于冰上作用20min，用細胞刮棒將細胞集中于平皿的一側(cè)，并用吸管把細胞碎片連同裂解緩沖液一起轉(zhuǎn)移至經(jīng)過冷卻的EP管內(nèi)，于4℃以12 000g將裂解物離心2min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一EP管內(nèi)，并在-70℃中保存。

PAGE電泳：配制1%的瓊脂糖凝膠；組裝灌膠模具及電泳槽，準備電泳裝置，并用瓊脂糖凝膠封邊；配制8%的分離用聚丙烯酰胺變性膠，在加入過硫酸胺和TEMED后，輕輕攪拌混勻，勿使凝膠聚合；小心用吸管將凝膠加入灌膠模具內(nèi)，至距梳齒約0.5cm，并避免產(chǎn)生氣泡，然后在分離膠上面加入一層約5mm厚的水層以隔絕空氣的接觸，直立置于室溫下20～60min，直至凝膠聚合。在凝膠聚合后，會在分離膠和水層之間出現(xiàn)一個清晰的折光線；吸盡分離膠上的水，將梳子置于分離膠上，直至梳齒遠端距分離膠約0.5cm；配制積層膠溶液，同樣在加入過硫酸胺和TEMED后，輕輕攪拌混勻，勿使凝膠聚合；用注射器將積層膠緩慢加入分離膠表面，注意不能產(chǎn)生氣泡，時溫下靜置20～30min，直至凝膠聚合。小心拔除梳子，不要將加樣孔撕裂；反復用電泳液沖洗加樣孔數(shù)次。以去除殘留的未聚合的丙烯酰胺及其它污物，然后將電泳緩沖液加入電泳槽中，短板接正極；將蛋白質(zhì)樣品(0.1μg/10μl)與5×SDS凝膠上樣緩沖液(1∶5 v/v)充分在一個EP管中混勻后,置于沸水浴中變性10min,稍作離心；用微量注射器將樣品加入加樣孔中,注意不能帶入氣泡,并使樣品不溢出；接通電源，短板對正極，保持恒壓為200V(注意調(diào)整電流，開始為100mA，電泳快結(jié)束時為60mA)，電泳持續(xù)約60min，且電泳在4℃下完成；通過肉眼觀察，當溴酚藍電泳至距離電泳槽底部約2～3cm時，關(guān)閉電源，停止電泳；從電泳槽中取出凝膠玻璃板，取出凝膠。

轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)移緩沖液及雙蒸餾水等均置于4℃低溫預處理；將硝酸纖維素浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中20min，勿用手指直接接觸硝酸纖維素膜，打開轉(zhuǎn)移盒，用轉(zhuǎn)移緩沖液將海綿墊及Whatman濾紙完全浸透，將濾紙剪成與待轉(zhuǎn)移的凝膠大小一致。勿用手指直接接觸濾紙；小心將凝膠置于三層Whatman濾紙上，避免產(chǎn)生氣泡，以轉(zhuǎn)移緩沖液濕潤膠面，小心從凝膠的一邊開始將硝酸纖維素膜放在膠面上，避免氣泡形成，并勿用手指直接接觸，然后在硝酸纖維素膜表面放三層Whatman濾紙，用干凈的小試管輕輕滾過濾紙-凝膠-硝酸纖維膜-濾紙“三明治”上，以消除可能存在的所有氣泡，然后將他們置于轉(zhuǎn)移盒中；將轉(zhuǎn)移盒置于電轉(zhuǎn)移裝置中，陽極對硝酸纖維膜一側(cè)，連接好電極，使與SDS相結(jié)合而帶負電荷的蛋白質(zhì)向正極泳動，在恒溫狀態(tài)下以200mA轉(zhuǎn)移60～120min，整個轉(zhuǎn)移過程置于4℃低溫環(huán)境中進行。

免疫顯色及結(jié)果分析: 終止電轉(zhuǎn)移，拆下轉(zhuǎn)移裝置，將濾紙揭下；將膜置于3%BSA/TBS溶液中，液面超過膜，在搖床上緩搖30～80min，保證充分封閉非特異性位點；棄去封閉液，用TBS洗膜三次；一抗反應：用0.5%BSA/TBS按1∶500稀釋一抗，將膜與一抗溶液置于封閉的塑料袋中在37℃下充分孵育，同時溫和搖動至少1h；洗膜：棄去一抗，用TBS洗膜三次，每次10min；二抗反應：棄去TBS，用0.5%BSA/TBS按1∶200稀釋二抗，將膜同上置于二抗溶液中，溫和搖動至少1h或過夜；洗膜：棄去二抗，用TBS洗膜三次，每次10min；顯色：配好NBT/BCIP顯色液后，在肉眼觀察下進行蘭色顯色反應，用雙蒸餾水終止顯色反應。

2 結(jié) 果

2.1質(zhì)粒的鑒定重組質(zhì)粒pCMX-mIκBα圖譜如圖1，質(zhì)粒DNA經(jīng)BamHⅠ與HindⅢ酶切后產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳顯示2條帶：分別為4.5、0.94kb，大小符合預期，見圖2。

2.2Westernblot分析mIκBα蛋白在大鼠HSC中的表達轉(zhuǎn)染pCMX-IκBαM的大鼠HSC內(nèi)IκBα基因表達高于未轉(zhuǎn)染組HSC，見圖3。

3 討 論

A為轉(zhuǎn)染組；B為大鼠肝細胞圖3 Western blot分析IκBαM蛋白在大鼠HSC中的表達

細胞在靜息狀態(tài)下，NFκB以無活性的潛在狀態(tài)存在于細胞漿中，它與一種抑制因子結(jié)合組成為一異源多聚體P50-P60-IκBα或IκBβ。三聚體中IκB類抑制因子的存在可阻遏P50-P60復合物的二聚體化，因此喪失活性。當細胞受到腫瘤壞死因子(TNF)、蛋白酶C激活物PMA等NFκB激活劑刺激時，IκB即從三聚體中解離出來，暴露出P50亞基上的易位信號和P60亞基上DNA結(jié)合位點，從而使異二聚物表現(xiàn)出NFκB活性，并從細胞質(zhì)中易位到細胞核中，與IκB基因序列相結(jié)合，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[1，2]。全部IκB蛋白均含有一個與NFκB連接的中心區(qū)，該區(qū)域由6個或更多的保守的錨蛋白重復構(gòu)成。另外IκB的C端區(qū)對其抑制活性至關(guān)重要的，而N端含有一個調(diào)控結(jié)構(gòu)域[3]。誘導型IκB降解依賴于刺激誘導的N端調(diào)控區(qū)2個保守的絲氨酸磷酸化，在IκBα對應的位點是S32和S36。IKK(IκB激酶)復合體經(jīng)由上游激活物與IKKγ(IκB激酶調(diào)控亞基)相互作用而活化，并導致結(jié)合NFκB的IκB磷酸化及降解，使IκBα迅速被26S蛋白酶體降解。Wang等[4]發(fā)現(xiàn)NFκB的抑制劑IκB的32位和36位蛋白殘基發(fā)生突變，即mIκBα，其失去磷酸化位點從而使IκB無法被降解而能夠持續(xù)地抑制NFκB活性。

通過mIκBα基因的轉(zhuǎn)入來抑制NFκB的活性從而達到誘導細胞凋亡的目的，目前主要應用于腫瘤細胞的基因治療方面。Sumitomo等[5]構(gòu)建了IκBα基因N端截短突變的腺病毒重組體，并將它轉(zhuǎn)入一個分泌多種細胞因子的膀胱癌細胞系KU-19-19細胞中，發(fā)現(xiàn)這個腺病毒重組體能有效感染該細胞系并持續(xù)表達對NFκB的抑制作用，且不會被磷酸化及水解，并能抑制KU-19-19細胞的生長及其細胞因子的產(chǎn)生。最有意義的是，發(fā)現(xiàn)這個腺病毒重組體的感染可以直接導致腫瘤細胞的凋亡，而癌旁正常細胞則未見明顯損傷。另外，Chen等[6]構(gòu)建了一種叫Adv-SR-IκBα的NFκB超級抑制物，將這種抑制物感染口腔磷狀細胞癌細胞(SCC)并表達后發(fā)現(xiàn)，該抑制物不但能抑制TNF-α誘導的NFκB激活，還能增強TNF-α誘導的Caspase-8和Caspase-3的激活。mIκBα經(jīng)腺病毒介導轉(zhuǎn)入耐受化療藥物的小鼠體內(nèi)腫瘤細胞中，能誘導腫瘤細胞對TNF-α或化療藥物致敏而發(fā)生凋亡，瘤體萎縮[7]。Duffey等[8]將mIκBα基因轉(zhuǎn)入表達前細胞因子IL-1、IL-6、IL-8和GM-CSF的頭頸部鱗狀上皮細胞癌細胞中，發(fā)現(xiàn)mIκBα能使該細胞大量凋亡。而且NFκB基本活性和TNF-α誘導后的激活活性均明顯被抑制，同時上述4種因子的產(chǎn)生亦受到抑制。隨后將此癌細胞接種到SCID小鼠體內(nèi)做類似研究也得到相似結(jié)果，由此表明，mIκBα基因的表達可以抑制腫瘤細胞在體內(nèi)的生長。

本實驗主要研究mIκBα表達對大鼠肝星狀細胞凋亡的作用。首先，通過脂質(zhì)介導mIκBα基因進入大鼠肝星狀細胞中：mIκBα真核表達載體pCMXMIκBα是以pCMX質(zhì)粒為基本載體，在其中插入mIκBα基因完整編碼序列構(gòu)成的。轉(zhuǎn)染方法上，本實驗選用了脂質(zhì)介導的轉(zhuǎn)染方法，其有效率是先前磷酸鈣沉淀法的5～10倍，且使用方便，并采用了第三代脂質(zhì)體Lipofectiamine2000，它的轉(zhuǎn)染能力較第一代脂質(zhì)體增強了2～30倍，對真核細胞轉(zhuǎn)染效率尤其高。轉(zhuǎn)染后經(jīng)G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的表達株，然后應用Western blot技術(shù)作mIκBα相應蛋白質(zhì)表達的檢測。

本研究將mIκBα基因成功導入大鼠肝星狀細胞，并獲得了高效、穩(wěn)定表達mIκBα的大鼠肝星狀細胞，為進一步從體外、體內(nèi)兩個層面探討mIκBα對大鼠肝星狀細胞凋亡的作用打下良好的實驗基礎。

[1]Ghosh S, May MJ, Kopp EB. NF-kappa B and rel proteins:Evalutionarily conserved mediators of immune responses[J].Annu Rev Immunol,1998,16:225-260.

[2]Arenzana-Seisdedos F, Turpin P, Rodriguez M,etal.Nuclear localization of I kappa B alpha promotes active transport of NF-kappa B from the nucleus to the cytoplasm[J].J Cell Sci,1997,110(3):369-378.

[3]Baldwin AS. The NF-kappaB proteins:New discoveries and insights[J].Annu RevImmunol,1996,14:649-683.

[4]Wang CY, Mayo MW, Baldwin AS,etal.TNF-and cancer therapy-induced apoptosis:Potentiation by inhibition of NF-kappa B[J].Science,1996,274:784-787.

[5]Sumitomo M, Tachibana M, Ozu C,etal.Induction of apoptosis of cytokine producing bladder cancer cells by adenovirus medicated I kappa B alpha over expression[J].Hum Gene Ther,2002,10(12):37247.

[6]Chen S, Fribley A, Wang CY. Potentiation of tumor necrosis factor-mediated apoptosis of oral squamous cell carcinoma cells by adenovirus-mediated gene transfer of NF-kappa B inhibitor[J].J Dent Res,2003,81(2):98-102.

[7]Baldwin AS，Control Bancroft CV, Chen Z,etal.Inhibition of transcription factor nuclear factor-kappa B inhibitor[J].J ClinInvest,2004,107(3):241-246.

[8]Duffey DC, Crowl Bancroft CV, Chen Z,etal.Inhibition of transcription factor nuclear factor-kappa B by a mutant inhibitor-kappa B alpha attenuates resistance of human head and neck squanous cell carcinoma to TNF-alpha caspase-mediated cell death[J].Br J Cancer,2005,83(10):1367-1374.

[9]Kagami S, Urushihara M, Kitamura A,etal.PDGF-BB enhances alpha1 beta1 integrin-mediated activation of the Erk/AP-1 pathway involved in collage matrix remodeling by rat mesangial cells[J].J Cell Physiol，2004，198:470-478.

[10]高春芳，盧倫根.纖維化疾病的基礎和臨床[M].上海:上海科技出版社,2004:199-201.

[11]Higashi K, Inagaki Y.Transcriptional repression of human alpha2(I)collage gene expression by interferon-gamma[J].J Biol Chem， 2003,278:5156-5162.

[12]Cutroneo KR, Chiu JF. Sense Oligonucleotide competition for gene promoter binding and activation[J].Int J Biochem Cell Biol，2003,35:32-38.

[13]Campbell MR, Gress CJ.Chicken collagen X regulatory sequences restrict transgene expression to hypertrophic cartilage in mice[J].Am J Pathol，2004,164:487-499.

[編輯] 一 凡

R34

A

1673-1409(2009)02-R009-04

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.02.003

2009-01-08

楊友誼(1964-)，男，湖北仙桃人，副教授，碩士，從事生物化學和分子生物學教學與研究工作。