Toll受體4在急性胰腺炎引起的血-腦脊液屏障通透性增高中的作用

丁震 劉俊 藺蓉 錢偉 侯曉華

Toll受體4在急性胰腺炎引起的血-腦脊液屏障通透性增高中的作用

丁震 劉俊 藺蓉 錢偉 侯曉華

目的研究Toll受體4(toll receptor-4，TLR-4)在急性胰腺炎(AP )合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷中的作用。方法將64只SD大鼠分為8組：對照組；急性水腫性胰腺炎(AEP)2、6 h組；急性壞死性胰腺炎(ANP)2、6、12、24、48 h組，每組8只。測定血-腦脊液屏障(BBB)通透性、胰腺病理損傷程度、組織TLR-4的表達，并分析其相互關(guān)系。結(jié)果對照組，AEP2、6 h組，ANP 2、6、12、24、48 h組的BBB通透性分別為1.55±0.29、1.64±0.17、1.69±0.24、1.89±0.12、2.66±0.32、2.91±0.29、2.89±0.69和1.84±0.07；胰腺病理分值分別為0、2.38±0.92、3.13±0.64、8.50±1.07、9.75±0.71、10.25±1.28、11.13±1.25和10.13±1.13。AEP組與對照組無顯著差異，ANP各組較AEP組顯著升高(Plt;0.05或Plt;0.01)。BBB通透性與胰腺損傷呈正相關(guān)(r=0.626,Plt;0.01)。對照組和AEP組無TLR-4 mRNA和蛋白表達，而ANP各組明顯表達,其表達水平與BBB通透性水平呈正相關(guān)(r=0.208，P=0.027)。結(jié)論ANP時存在BBB通透性的升高，CNS內(nèi)TLR-4信號途徑的激活可能參與了ANP所引起的血-腦脊液屏障通透性的升高。

胰腺炎； 血腦屏障； 通透性； Toll樣受體4

胰性腦病是急性胰腺炎(AP)的重要并發(fā)癥，其臨床發(fā)生率約3%～27%，病死率高達40%以上[1]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)存在血-腦脊液屏障(blood brain barrier，BBB)，它能保護大腦免受外周致病因子的攻擊，其損傷和通透性的升高是多種CNS炎癥及病變的前提[2-3]。Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR-4)主要介導細菌內(nèi)毒素(LPS)誘導的天然免疫反應,近年來的研究顯示，BBB構(gòu)成細胞表面存在TLR-4，并且其信號通路在許多無菌性炎癥中也被激活，并發(fā)揮重要作用[4-5]。本實驗觀察BBB通透性在AP時的變化規(guī)律及與TLR-4表達的關(guān)系，探討TLR-4在AP合并CNS損傷中的可能作用。

材料與方法

一、實驗分組

健康SD大鼠64只，購自華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心，體重250～350 g。根據(jù)體重采取配偶隨機分組法將動物分為8組：對照組；急性水腫性胰腺炎(AEP)2、6 h組；急性壞死性胰腺炎(ANP)2、6、12、24、48 h組。每組大鼠8只。采用許永春等[6]報道的改良胰膽管注射法制備大鼠AEP、ANP模型。并從胰腺水腫、白細胞浸潤、出血、壞死4個方面分4個等級進行評分[7]。

二、BBB通透性測定

以透過BBB伊文藍量的多少反映BBB的通透性。先制作標準曲線。大鼠處死前0.5 h注入2%伊文藍溶液5 ml/kg體重。處死前心內(nèi)插管灌注生理鹽水，以沖掉血管內(nèi)殘存的伊文藍。隨后完整取出右側(cè)大腦，稱重后置入7.5 %三氯乙酸溶液中。勻漿、離心、取上清液，按1∶3的比例用乙醇稀釋，測定其A620值，通過標準曲線計算其伊文藍的含量。

三、TLR-4測定

1．免疫組化染色：處死大鼠并行4%多聚甲醛灌注，取大鼠中腦浸入4%多聚甲醛固定16～24 h，30%蔗糖脫水后冷凍切片，常規(guī)免疫組化染色。TLR-4一抗(santa cruz公司)工作濃度為1∶100，二抗采用兔源性抗體試劑盒(中杉金橋公司)。

2．RT-PCR：取新鮮大鼠大腦，常規(guī)抽提總mRNA，RT-PCR法測定TLR-4 mRNA的表達。根據(jù)GenBank公布的cDNA序列，利用Primer5軟件設(shè)計引物，以β-actin作為內(nèi)參照。TLR-4上游引物：5′-GCCGGAAAGTTATTGTGGTGGT-3′，下游引物：5′- ATGGGTTTTAGGCGCAGAGTTT-3′，擴增產(chǎn)物356 bp。擴增產(chǎn)物電泳、掃描，以TLR-4條帶與β-actin條帶灰度值比作為TLR-4 mRNA的相對表達量。

四、統(tǒng)計學處理

BBB通透性與對照組比較采用獨立t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法，統(tǒng)計運算由SPSS11.0軟件完成，Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、BBB通透性的變化及其與胰腺損傷的關(guān)系

對照組，AEP 2、6 h組，ANP 2、6、12、24、48 h組的BBB通透性分別為1.55±0.29、1.64±0.17、1.69±0.24、1.89±0.12、2.66±0.32、2.91±0.29、2.89±0.69和1.84±0.07。2個AEP組與對照組均無顯著差異(Pgt;0.05)。與對照組比較，ANP組BBB通透性從2 h起開始升高(Plt;0.05)，12 h時達到高峰，并持續(xù)至24 h(Plt;0.01)，48 h才有所下降(Plt;0.05)。以正常值上限為1.84計算，ANP大鼠BBB通透性升高率為77.5%(31/40)。

對照組，AEP 2、6 h組、ANP 2、ANP 6、12、24、48 h組的胰腺病理分值分別為0、2.38±0.92、3.13±0.64、8.50±1.07、9.75±0.71、10.25±1.28、11.13±1.25和10.13±1.13，與BBB通透性呈正相關(guān)(r=0.626，Plt;0.01)。

二、TLR-4表達及其與BBB通透性的關(guān)系

對照組和2個AEP組大腦均未見TLR-4蛋白陽性表達，ANP各組均可見TLR-4蛋白表達，其表達部位主要位于血管壁(圖1)，同樣，TLR-4 mRNA 也僅在ANP各組表達(圖2)。

各組TLR-4 mRNA相對表達量與BBB通透性呈明顯正相關(guān)(r=0.208，P=0.027，圖3)。

討 論

血-腦脊液屏障是CNS的重要自我保護系統(tǒng)，而BBB的通透性升高及損傷則是CNS出現(xiàn)炎癥性病變的前提[2-3]，因此我們認為，研究胰性腦病發(fā)病的關(guān)鍵在于研究血-腦脊液屏障的通透性變化及其影響因素。

本實驗結(jié)果顯示，AEP組BBB通透性與對照組無明顯差異，均明顯低于ANP組，這一點和臨床上輕癥急性胰腺炎患者一般無全身性的并發(fā)癥相吻合。Farkasa等[8]曾經(jīng)報道，大鼠靜脈注射?；悄懰徕c后出現(xiàn)BBB通透性升高，并于6 h時達到頂峰。本實驗ANP大鼠BBB通透性達到高峰的時間為12 h，這可能是因為Farkasa等的實驗沒有設(shè)計ANP 12 h組的緣故。此外，本實驗中BBB通透性升高率(77.5%)低于劉小豐等[9]報道的90%，這可能是因為后者造模是在血管內(nèi)注射溶血卵磷脂，直接破壞BBB的緣故。

圖1ANP組大腦組織TLR-4蛋白表達(免疫組化×1 000)圖2各組RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

圖3TLR-4 mRNA表達與血-腦脊液屏障通透性的相關(guān)性

本次實驗對造模大鼠的胰腺進行了病理評分，結(jié)果顯示許永春等[6]報道的AEP造模方法切實可行。并且胰腺的病理評分與血-腦脊液屏障通透性改變直接相關(guān)，提示胰腺炎隨著病情的加重，對CNS的影響也在增加，這與臨床重癥急性胰腺炎(SAP)容易導致多器官功能衰竭的規(guī)律相一致。

TLR-4由于在介導炎癥反應信號轉(zhuǎn)導中的重要作用而越來越受到重視，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)TLR-4在SAP及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中也有重要作用[10-12]。本實驗顯示TLR-4信號通路的激活僅僅發(fā)生在ANP，這和CNS并發(fā)癥僅存在于SAP的臨床特點相符合。TLR-4的表達主要位于血管周圍，提示TLR-4的激活信號很可能來自于血液，因為在SAP時血液循環(huán)中存在TLR-4的激活因子如內(nèi)毒素、熱休克蛋白等。此外，TLR-4表達的量與BBB通透性的升高相一致，但對于兩者間的相關(guān)是否為因果關(guān)系，我們還將在今后的實驗中進一步研究。

綜上所述，BBB通透性的升高與大鼠胰腺炎炎癥程度直接相關(guān)，并且在大鼠ANP模型中為一常見表現(xiàn)，其發(fā)展呈現(xiàn)一定的時間依賴性。TLR-4作為重要的炎癥信號傳遞分子， SAP時在CNS內(nèi)表達水平明顯升高，并且表達水平與BBB通透性的變化也相關(guān)，提示TLR-4信號通路參與了AP時CNS系統(tǒng)的病變。

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2008-04-03)

(本文編輯：屠振興)

Roleoftollreceptor-4intheincreaseofbloodbrainbarrierpermeabilitycausedbyacutepancreatitis

DINGZhen,LIUJun,LINRong,QIANWei,HOUXiao-hua.

DepartmentofGastroenterology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

HOUXiao-hua,Email:houxh@public.wh.hb.cn

ObjectiveTo investigate the relation between the expression of toll receptor-4 (TLR-4) and the increase of blood brain barrier (BBB) permeability in the rats with acute pancreatitis.MethodsMale Sprague-Dawley rats were randomly divided into 8 groups: control group; acute edematous pancreatitis (AEP) 2 h, 6 h groups; acute necrotizing pancreatitis (ANP) 2 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h groups with 8 rats in each group. The BBB permeability, pathological score of pancreas, TLR-4 expression were determined and the relationships between them were analyzed.ResultsThe BBB permeability in control group; acute edematous pancreatitis (AEP) 2 h, 6 h groups; ANP 2 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h groups were 1.55±0.29, 1.64±0.17, 1.69±0.24, 1.89±0.12, 2.66±0.32, 2.91±0.29, 2.89±0.69 and 1.84±0.07, respectively；the pathological scores of pancreas were 0,2.38±0.92, 3.13±0.64, 8.50±1.07, 9.75±0.71, 10.25±1.28, 11.13±1.25 and 10.13±1.13, respectively；there was no significant difference between AEP groups and control group, while there was significant difference between AEP groups and ANP groups (Plt;0.05 orPlt;0.01). BBB permeability was correlated with pancreatic injury (r=0.626,Plt;0.01). There was no TLR-4 mRNA and protein expression in the control and AEP group, while they were significantly expressed in ANP groups, and the expression were positively related with BBB permeability (r=0.208,P=0.027).ConclusionsBBB permeability was present in the course of ANP. Activation of TLR-4 signal pathway may be involved in the BBB permeability increase caused by ANP.

Pancreatitis; Blood-brain barrier; Permeability; Toll-like receptor 4

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.012

430022 湖北武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科

侯曉華，Email: houxh@public.wh.hb.cn