環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用

于　荔

[摘要] 目的 探討環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。方法 采用我院2008年10月門診或住院患者85份試驗(yàn)用的含結(jié)核桿菌的陽(yáng)性痰液和陰性痰液,通過(guò)染色涂片鏡檢和經(jīng)典PCR的方法及使用改良羅氏培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)予以定性,并與LAMP法檢測(cè)結(jié)果比較。結(jié)果 LAMP法與培養(yǎng)法、Amplicor MTB PCR法檢測(cè)痰液中結(jié)核分枝桿菌的陽(yáng)性率無(wú)明顯差異。結(jié)論 LAMP法是一種新型的核酸擴(kuò)增方法;由于它是近年來(lái)興起的一種技術(shù),是一種便捷、特異性強(qiáng)和靈敏度高的快速基因檢測(cè)技術(shù)。

[關(guān)鍵詞] 環(huán)介導(dǎo)等溫護(hù)增技術(shù);臨床檢測(cè)

[中圖分類號(hào)] R446.1 [中圖分類號(hào)] A[文章編號(hào)] 1673-9701(2009)24-43-02

日本學(xué)者Notomi等[1]于2000年發(fā)明了一種全新的核酸擴(kuò)增方法——環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothemal amplifi cation LAMP),其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物,利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件(65℃左右)保溫幾十分鐘,即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)[2]。不需要模板的熱變性、長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過(guò)程,該技術(shù)的問(wèn)世解決了基于核酸的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的諸多難題,使其作為快速診斷方法成為可能.,已經(jīng)被廣泛用于細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)等的檢測(cè),動(dòng)物胚胎性別鑒定,食品衛(wèi)生檢疫及基因芯片的開(kāi)發(fā)等,我們采用LAMP法對(duì)痰液中和培養(yǎng)基中的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè),并分析報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)樣本

試驗(yàn)用的含結(jié)核桿菌的陽(yáng)性痰液和陰性痰液來(lái)自選自我院2008年10月門診或住院患者85份,全部樣本均通過(guò)染色涂片鏡檢和經(jīng)典PCR的方法及使用改良羅氏培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)予以定性。

1.2主要試劑

Bst DNA聚合酶與Tai I限制性內(nèi)切酶購(gòu)自英國(guó)Biolabs公司,三甲銨乙內(nèi)酯(Betaine)購(gòu)自瑞士Fluka公司。硫酸鎂購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,SYBR染料購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,DNA標(biāo)志物購(gòu)自北京天根生化科技有限公司,脫氧核苷三磷酸(dNTP)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件,P<0.05為差異具有顯著性。

2LAMP反應(yīng)DNA引物的設(shè)計(jì)利用

ICBgyrB數(shù)據(jù)庫(kù)及RIDOM數(shù)據(jù)庫(kù)尋找結(jié)核分枝桿菌基因序列(GenBank accession No.CP000611)利用軟件選取結(jié)核分枝桿菌的特異性序列,該序列利用PrimerExplorerlV軟件進(jìn)行進(jìn)一步分析,設(shè)計(jì)1套6種引物分別是前外引物B3、后外引物F3、前內(nèi)引物FIP、后內(nèi)引物BIP、環(huán)狀引物L(fēng)F及I,B,上述引物識(shí)別目標(biāo)基因序列中的8個(gè)特定區(qū)域。所有引物由上海賽百勝基因技術(shù)有限公司合成。25ulLAMP反應(yīng)體系:FIP和BIP各1.6pmol/L, F3和B3各0.2μmol/L, 1.4mmol/L dNTPs、 1.0mol/L Betaine、6.0mmol/LMgSO4、0.8mmol/L甜菜堿,2mmol/L dNTP,65℃反應(yīng)60min,80℃5min終止反應(yīng),LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物取5μl,在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行進(jìn)行電泳分析,同時(shí)LAMP擴(kuò)增的每個(gè)管中加入1.0μl 20×Smartgreen熒光染料混勻,在紫外燈(302nm)下顯影。

3結(jié)果

見(jiàn)表1,結(jié)果表明,LAMP法與培養(yǎng)法、Amplicor MTB PCR法檢測(cè)痰液中結(jié)核分枝桿菌的陽(yáng)性檢出率無(wú)明顯差異(P> 0.05)。

4討論

LAMP是一種嶄新的DNA擴(kuò)增方法,具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。LAMP原理[3]:引物的設(shè)計(jì):基于靶基因3端的F3c,F2c 和F1c區(qū)以及5端的B1,B2和B3區(qū)等6個(gè)不同的位點(diǎn)設(shè)計(jì)4種引物。FIP引物:上游內(nèi)部引物,由F2區(qū)組成,F2 區(qū)與靶基因3端的F2c區(qū)域互補(bǔ),與靶基因5端的F1c區(qū)域序列相同。F3引物:上游外部引物,由F3區(qū)組成,并與靶基因的F3c 區(qū)域互補(bǔ)。BIP引物:下游內(nèi)部引物,由B2區(qū)組成,B2區(qū)與靶基因3端的B2c區(qū)域互補(bǔ),與靶基因5端的B1c區(qū)域序列相同。

DNA在65℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),任何一個(gè)引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí),另一條鏈就會(huì)解離,變成單鏈。反應(yīng)中鏈置換型DNA聚合酶,能使后階段退火的引物置換前面引物所形成的鏈,在其作用下,以FIP引物砣區(qū)段的3末端為起點(diǎn),與模板DNA互補(bǔ)序列配對(duì),啟動(dòng)復(fù)制一條新鏈。F3引物與靶DNA的F3c序列雜交,又通過(guò)鏈置換型DNA聚合酶的作用,開(kāi)始靶DNA互補(bǔ)鏈的合成,同時(shí)置換出FIP引物合成的DNA鏈。被置換出的DNA鏈在5末端存在互補(bǔ)的Flc和F1區(qū)段,能發(fā)生自我堿基配對(duì),形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。同時(shí)這條單鏈DNA,又可作為模板,在另一端結(jié)合BIP引物和B3引物合成一條雙鏈,并置換出一條單鏈DNA。此時(shí),被置換的單鏈DNA兩端都存在互補(bǔ)序列,自我堿基配對(duì)后整條鏈呈現(xiàn)啞鈴狀結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)是LAMP擴(kuò)增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)[4]。在啞鈴結(jié)構(gòu)中,以3末端的F1區(qū)段為起點(diǎn),以自身為模板,進(jìn)行DNA合成延伸。同時(shí),FIP引物上的砣與環(huán)上的F2c雜交,啟動(dòng)新一輪鏈置換反應(yīng)。其置換出的單鏈核酸也會(huì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu),BIP引物上的B2與環(huán)狀結(jié)構(gòu)上存在的B2c雜交,啟動(dòng)又一輪擴(kuò)增。反應(yīng)終產(chǎn)物是花椰菜樣的莖一環(huán)結(jié)構(gòu)DNA組成的混合物,即由在同一條鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成大小不一的結(jié)構(gòu)[5]。

LAMP具有許多迄今為止的擴(kuò)增方法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn):(1)只需一恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng),不需要特殊試劑,不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性。(2)高特異性:應(yīng)用6個(gè)區(qū)段,4種引物,并且這6個(gè)區(qū)段的順序也有規(guī)定。原理上LAMP擴(kuò)增的特異性很高,因此可以根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷目標(biāo)基因的存在與否,即能夠進(jìn)行細(xì)菌或病毒的定性檢測(cè)。(3)快速、高效擴(kuò)增:整個(gè)擴(kuò)增在不到lh即可完成,且產(chǎn)率可達(dá)到0.5mg/mL。若在引物上再進(jìn)一步改進(jìn),可大大提高其擴(kuò)增效率,擴(kuò)增時(shí)間在原來(lái)的基礎(chǔ)上減少1/3~1/2。(4)靈敏度高:擴(kuò)增模板可達(dá)10拷貝或更少。(5)步驟簡(jiǎn)單:擴(kuò)增RNA只要在DNA基因擴(kuò)增試劑的基礎(chǔ)上加上逆轉(zhuǎn)錄酶,就能夠完全像DNA基因擴(kuò)增那樣,一步實(shí)現(xiàn)RNA擴(kuò)增。(6)鑒定簡(jiǎn)便:在核酸大量合成時(shí),從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合,產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂沉淀。它有極高的特異性,只要用肉眼觀察或濁度儀檢測(cè)沉淀濁度就能判斷擴(kuò)增與否,缺點(diǎn)只能有2種結(jié)果:擴(kuò)增和不擴(kuò)增。靶序列長(zhǎng)度控制在300bp以下,一旦產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,則不易鑒別[6]。

通過(guò)本組數(shù)據(jù)觀察,LAMP法與培養(yǎng)法檢測(cè)痰液及Amplicor MTB PCR法中結(jié)核分枝桿菌結(jié)果比較,數(shù)據(jù)檢測(cè)無(wú)明顯差異,(P>0.05),進(jìn)一步說(shuō)明LAMP法檢測(cè)準(zhǔn)確性和適用性,由于結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)周期較長(zhǎng),使用羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)所需時(shí)間長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月[7],不利于結(jié)核分枝桿菌的快速檢測(cè)。PCR所需要的一系列變性、退火、延伸等復(fù)雜程序,使用擴(kuò)增反應(yīng)在恒溫的條件下進(jìn)行,沒(méi)有DNA的變、復(fù)性過(guò)程,節(jié)省了大量時(shí)間;同時(shí)減少DNA大片段聚合酶與擴(kuò)增核酸的污染機(jī)會(huì);需要的試驗(yàn)設(shè)備大大簡(jiǎn)化。

總之,LAMP法是一種新型的核酸擴(kuò)增方法;它是近年來(lái)興起的一種技術(shù),是便捷、特異性強(qiáng)和靈敏度高的快速基因檢測(cè)技術(shù)。

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(收稿日期:2009-03-23)