如何利用發(fā)光細(xì)菌檢驗(yàn)水中有毒有害物質(zhì)

劉　輝

摘要：水源污染引發(fā)了一系列的問題，首先是水質(zhì)檢驗(yàn)，特別是水中有毒有害物質(zhì)的檢驗(yàn)問題，水中有毒有害物質(zhì)可以通過各種水質(zhì)分析方法予以檢出，然后對(duì)之進(jìn)行對(duì)人體健康的綜合評(píng)價(jià)，檢測(cè)水中有毒有害物，有時(shí)采用生物方法，如魚毒理學(xué)生物檢驗(yàn)，水蚤試驗(yàn)等；也有采用近代遺傳毒理學(xué)的方法，如Ames致突變?cè)囼?yàn)[1]，姐妹染色體交換試驗(yàn)等等，則可提供水質(zhì)對(duì)人體健康影響的信息，本文則介紹利用發(fā)光細(xì)菌檢驗(yàn)水中有毒有害物質(zhì)的基本原理，檢驗(yàn)方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞：水質(zhì)檢驗(yàn)；發(fā)光細(xì)菌；有毒有害物質(zhì)

1發(fā)光細(xì)菌的存在、分離、純化和培養(yǎng)[2]

廣闊的海洋是發(fā)光細(xì)菌生活的大本營(yíng)，從近海沿岸到南北極；從海水表面到深達(dá)1000米的海底都可找到發(fā)光細(xì)菌，只有少數(shù)生活在淡水湖泊河流中；有的寄生于各種海洋動(dòng)物如海魚的發(fā)光器官中；有的獨(dú)立生活在海水中，其數(shù)量依外界條件的變化而異，據(jù)測(cè)定夏秋季的海水中每毫升多達(dá)幾十到幾百個(gè)，發(fā)光細(xì)菌屬于腸道菌屬，分為十個(gè)種四個(gè)屬，在我國(guó)海洋中也陸續(xù)分離到十個(gè)種的六種，其中包括我國(guó)特有的新種。

發(fā)光細(xì)菌可以直接從海水中和海魚的體表和內(nèi)臟中分離，所采用的培養(yǎng)基為：胰蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，甘油0.3%，KH2PO40.1%，Na2HPO40.5%，NaCI3%，瓊脂2%，pH6.5。高壓滅菌后制成平板，將海魚或無脊椎動(dòng)物（如烏賊）切成3～4cm大小小塊，或取其內(nèi)臟放入滅菌培養(yǎng)皿中20℃培養(yǎng)12－18小時(shí)，在暗室中尋發(fā)光點(diǎn)，用接種環(huán)挑取發(fā)光點(diǎn)，在營(yíng)養(yǎng)平板上，線培養(yǎng)后形成單個(gè)發(fā)光菌，再挑取單菌落反復(fù)劃線分離幾次，即可得到純化的發(fā)光菌株，將純化的菌株接種入同樣成分的斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)12小時(shí)后，在4℃下保存，每月轉(zhuǎn)接一次，可長(zhǎng)期保存活力，使用前接種到液體培養(yǎng)基中20℃下振蕩培養(yǎng)10－12小時(shí)，用磷酸緩沖液稀釋后備用。

國(guó)內(nèi)外一般都用明亮發(fā)光桿菌(Photobacterium Phospholcum)作有毒有害物的檢驗(yàn)，上海華東師范大學(xué)已將此菌種制成干燥粉劑-20℃下可長(zhǎng)期保存，使用極為方便。

2發(fā)光菌的發(fā)光機(jī)理

微生物在氧化代謝或呼吸作用過程中得到能量，呼吸作用等于生物的氧化作用，好氣性細(xì)菌具有細(xì)胞色素氧化還原酶系統(tǒng)，由于好氣性細(xì)菌的細(xì)胞色素可以作為氫的最終受體而利用空氣中的氧，底物的氫傳遞到NAD（煙酰胺腺嘌呤核苷酸）的脫氫酶的輔基上，結(jié)果形成還原型的AAD-H2，它可以將氫傳遞給黃素腺嘌呤二核苷酸FAD，后者轉(zhuǎn)化為FAD-H2，就可以傳遞給細(xì)胞色素，能量以ATP（三磷酸腺苷）的形式釋放。

發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光過程是一種光呼吸過程，是上述電子傳遞鏈上的一個(gè)側(cè)支[2]，還原型的黃素單核苷酸，F(xiàn)MNH2充當(dāng)反應(yīng)的底物，螢光酶起催化作用，長(zhǎng)鏈脂肪醛起作改變螢光酶構(gòu)造的“修飾”作用。螢光酶通過分子氧催化FMNH2和脂肪醛(RCHO)的氧化，這種氧化還原反應(yīng)結(jié)果便產(chǎn)生磷光(465～490nm之間較多)。外界條件和培養(yǎng)基成分pH，溫度，氧濃度變化會(huì)影響細(xì)菌的發(fā)光，而有毒的化學(xué)物質(zhì)，重金屬離子，抗生素，化學(xué)治療劑，農(nóng)藥等同樣會(huì)影響細(xì)菌發(fā)光，故采用發(fā)光細(xì)菌作為敏感的指標(biāo)物測(cè)定有毒有害物是可能的。

3發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)有毒有害的方法[3]

儀器：SHG-1型生物化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x（上海市技術(shù)監(jiān)督局實(shí)驗(yàn)工廠產(chǎn)品）或Microtox 2055型毒物分析系統(tǒng)（美國(guó)MICROBICS CORPORATION產(chǎn)品）

培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基：酵母膏5g，胰蛋白胨5g，NaCI40g，Na2HPO45g，KH2PO4lg，甘油3g，蒸餾水1000ml，pH6.5。

固體培養(yǎng)基：上述液體培養(yǎng)基成份加2%瓊脂即可。

稀釋用磷酸緩沖液：Na2HPO45g，KH2PO4lg，

NaCI30g，蒸餾水100ml，pH6.5。

水樣濃縮。作某化學(xué)物質(zhì)的試驗(yàn)只需配制一定濃度的溶液即可，進(jìn)行水樣中有毒有害物質(zhì)的試驗(yàn)則需事先進(jìn)行水樣中毒害物的吸附，洗脫和濃縮。

取一定體積水樣V升（視水質(zhì)而定），用大孔樹脂(XAD系列事先分別經(jīng)甲醇、乙腈、丙酮回流8小時(shí)后保存于甲醇中)，用重蒸乙醚洗脫，濃縮至殘?jiān)?，?ml重蒸過的二甲亞砜溶解之。

1ml≈1V升水樣0.1ml≈0.1V升水樣

4 測(cè)定步驟

4.1 菌體活化：裝置為0.5ml干燥菌劑，開封后注入2～3ml冷的稀釋液，在旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩2～3分鐘，20℃平衡5～10分鐘，使其活化，待發(fā)光穩(wěn)定后即為活化菌懸浮液，置4℃下備用（活化后一天可用）。

菌液處理：吸取不同體積（視水質(zhì)而定）二甲亞砜水樣濃縮液，分別在試管中用無菌蒸餾水稀至1ml，加入1ml緩沖液，然后再加入0.1ml菌懸浮液，搖勻，在一定溫度下(20±1℃)反應(yīng)10分鐘。

并同時(shí)以二甲亞砜作對(duì)照試驗(yàn)。

用SAG-1型發(fā)光測(cè)量?jī)x測(cè)定光強(qiáng)度。

活菌計(jì)數(shù)。在測(cè)定光強(qiáng)度的同時(shí)用上述加有菌懸浮液的稀釋液稀釋涂布營(yíng)養(yǎng)平板，23℃培養(yǎng)12～16小時(shí)，計(jì)算活菌數(shù)。

結(jié)果計(jì)算：相對(duì)抑光率=對(duì)照管光強(qiáng)－樣品管光強(qiáng)／對(duì)照管光強(qiáng)×100％

細(xì)菌死亡率=對(duì)照活菌數(shù)－樣品組活菌數(shù)／對(duì)照組合菌數(shù)×100％

對(duì)于單一化學(xué)物質(zhì)當(dāng)達(dá)到抑光率為50%時(shí)的濃度用EC50表示，目前已有大量的有機(jī)物測(cè)得了其EC50值[4]。

對(duì)于水樣試驗(yàn)結(jié)果只能用水樣體積表示，EV50即表示抑光率為50%時(shí)所相對(duì)應(yīng)的水樣體積。

5 試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)于某個(gè)水樣品可根據(jù)EC50評(píng)價(jià)其毒性的有無，按照25%的準(zhǔn)則，當(dāng)某個(gè)水樣品的EC50 25%時(shí)可記為有毒，按50%準(zhǔn)則，某個(gè)水樣的EC50≤50%可記為有毒[5]，還有一些其它分級(jí)方法。如何用發(fā)光細(xì)菌的檢驗(yàn)結(jié)果來評(píng)價(jià)水質(zhì)進(jìn)行分類是一個(gè)有待研究的問題，目前只能用以在相同條件下比較不同水樣的毒性，即加入同一水樣體積后測(cè)定其抑光率，抑光率大小評(píng)價(jià)其毒性；或者測(cè)得其EV50，依EV50的大小評(píng)價(jià)其毒性。

參考文獻(xiàn)

[1]岳舜琳：“給水環(huán)境毒理學(xué)簡(jiǎn)介”《上海城鎮(zhèn)供水》1988年1期14-17頁(yè)。

[2]吳自榮：觀察生物發(fā)光現(xiàn)象的好材料--發(fā)光細(xì)菌《生物學(xué)通報(bào)》1986年第6期。

[3]吳自榮等“以發(fā)光細(xì)菌作指示生物快速評(píng)價(jià)塑料包裝材料的生物毒性”《中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)》1987年3卷第4期。

[4]KLAUS L.E.KAISER;Photobacterium pho phoreum Toxicity Bioassay 11,Toxicity Data CompilationToxicity Assesmint:An International Journal Vo1.3 195-237(1988)。

[5]A.A.Bulich;A Practical and Reliable Mlthod for Monitoring the Toxicity of Aqualic SampltsMar ch/April 1982 P.45-47。

作者簡(jiǎn)介：劉輝：1989年至今在鹽山水務(wù)局工作?，F(xiàn)任河北省鹽山縣水務(wù)局化驗(yàn)室主任，助理工程師。多年來一直從事水質(zhì)化驗(yàn)與水資源開發(fā)利用研究工作。于1996年9月在北京農(nóng)民大學(xué)進(jìn)修。