甘草查爾酮A減輕順鉑誘導的人腎小管上皮細胞HK-2損傷的實驗研究

王欣瑜，彭 力

順鉑具有抗腫瘤譜廣、抗癌活性高、療效可靠、價格低廉的優(yōu)點，作為一線治療方案廣泛用于實體瘤的治療[1]。盡管采用了水化療法，但嚴重的毒副作用仍極大影響了癌癥患者的治療和生存[2]。腎毒性是順鉑臨床主要限制性毒性，尚缺乏有效防護手段。因此，治療和預防順鉑腎毒性是臨床化療過程中亟待解決的重要問題。順鉑在腎臟內長時間的蓄積會抑制活性氧簇(ROS)的還原清除或增加活性氧的產生，使細胞中ROS水平升高，啟動機體氧化應激過程，導致組織器官的損傷[2-3]。近年來，許多中藥有效成分可以通過參與調節(jié)不同環(huán)節(jié)抑制活性氧的產生發(fā)揮抗氧化作用[4]。甘草作為寧夏的道地中藥材，其有效成分甘草査爾酮A(Lico A)表現(xiàn)出抗炎、抗氧化等生物活性，在臨床上具有廣泛的應用前景[5]。研究表明，甘草查爾酮A具有強大的抗氧化能力，可增加抗氧化酶表達，減少氧化應激[6]，對缺血缺氧性腦病的神經(jīng)細胞具有保護作用[7]，對CCl4所致?lián)p傷的大鼠肝臟的保護作用也得到證實[8]。但甘草查爾酮A是否能減輕順鉑所致腎小管上皮細胞的損傷，尚無文獻報道。本文采用人腎近端小管上皮細胞株HK-2，評價甘草查爾酮A對順鉑致傷的HK-2細胞的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料：順鉑(Pt含量65%，批號B12J10L79601)、甘草查爾酮A(純度≥96%，批號C15A10M94486)購于上海源葉生物科技有限公司;青鏈霉素混合液、DMEM-F12培養(yǎng)基和胰蛋白酶購于Gibco / Thermo Fisher Scientific公司(美國)；胎牛血清購于上海吉泰生物科技公司；細胞培養(yǎng)耗材購于Costar公司(美國)；CCK-8試劑盒、凋亡試劑盒和DEPC水購于江蘇碧云天生物技術公司；Total RNA提取試劑(RNAiso Plus)購于寶生物工程(大連)有限公司；HiScript III RT SuperMix for PCR 購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；iTaq Universal SYBR Green Supermix 購于Bio-Rad公司(美國)；PCR 反應引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成；其余試劑均為市售。

1.2 主要儀器：細胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher，美國)，Synergy H1全功能酶標儀(Bio-Tek Instruments，美國)，CFX96 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad，美國)，BD Accuri C6流式細胞儀(BD biosciences,美國)，Thermo 1300 系列A2型生物安全柜(Thermo Scientific，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)：人腎小管上皮細胞HK-2購自中喬新舟生物科技有限公司。使用10%胎牛血清(FBS)和100 IU/mL青鏈霉素的DMEM-F12(1∶1)培養(yǎng)基于37 ℃，含5% CO2，在相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當密度達到90%后進行傳代，取3～10代的細胞用于實驗。

1.3.2 細胞給藥和分組：HK-2細胞點板24 h后，分為4組給藥，分別為對照組、順鉑組、合用組(順鉑+甘草查爾酮A)、甘草查爾酮A組。對照組給予不含藥的培養(yǎng)基，與其他組平行操作；順鉑組給予順鉑20 μM；合用組同時給予順鉑20 μM和LicoA 4 μM；甘草查爾酮A組給予LicoA 4 μM；孵育12或24 h，進行后續(xù)實驗。

1.3.3 細胞增殖試驗：將HK-2細胞按1×104個細胞/孔的密度在96孔板中鋪板，按上述分組給藥孵育。培養(yǎng)24 h后，吸去上清,每孔加入100 μL稀釋好的1×CCK8溶液于37 ℃培養(yǎng)4 h后，酶標儀上450 nm波長下測定OD值。細胞活力(%)=(OD藥物-OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%，使用graphpadprism 8計算IC50。順鉑濃度設定分別為2、5、10、20、40、80、100 μM。Lico A的濃度為4 μM，該濃度對HK-2細胞活力沒有抑制，且藥效明顯。

1.3.4 細胞凋亡檢測：在6孔板中以2×105個細胞/孔的密度鋪板，按上述分組給藥孵育。培養(yǎng)24 h后，按照Annexin V-FITC試劑盒說明書進行樣品處理，每個樣品分別添加195 μL結合液、5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液，室溫避光孵育20 min，隨后置于冰浴中，上流式細胞儀機檢測。凋亡率=早期凋亡率(右下象限百分比)+晚期凋亡率(右上象限百分比)。

1.3.5 熒光定量PCR檢測：在12孔板中以1×105個細胞/孔的密度鋪板，按上述分組給藥孵育。培養(yǎng)12 h后，提取總RNA，cDNA合成試劑盒合成cDNA，qRT-PCR檢測細胞中caspase-3、caspase-8、caspase-9，β-actin mRNA水平。反應過程:95 ℃預變性反應 90 sec，PCR 循環(huán)反應(包括 95 ℃ 30 sec、退火溫度 30 sec、72 ℃ 30 sec)進行40個循環(huán);0.5 ℃/5 sec 從 65 ℃升溫至 95 ℃，進行溶解曲線分析。采用Livak法計算mRNA水平。

2 結果

2.1 甘草查爾酮A對順鉑致HK-2細胞增殖抑制的影響：隨著順鉑濃度的增大，細胞增殖被抑制的情況越來越嚴重。順鉑在HK-2細胞上24 h的IC50為28.52 μM，見圖1至圖2(目錄后)。從圖2可知，與對照組比較，甘草查爾酮A組HK-2細胞活力無變化(P> 0.05)，順鉑組細胞活力顯著下降(P<0.05)；與順鉑組比較，合用組的細胞活力由(40.52±5.65)%上升到(69.42±5.54)%(P<0.05)，表明甘草查爾酮A可以顯著改善由順鉑誘導的HK-2細胞的生長抑制。

2.2 甘草查爾酮A對順鉑致HK-2細胞凋亡的影響：Annexin V-FITC和碘化丙啶染色，與對照組相比，順鉑組凋亡細胞比例由(5.71±1.20)%上升到(20.33±1.81)%。合用甘草查爾酮后，合用組凋亡率下降至(7.77±1.98)%，與順鉑組比較差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，說明合用甘草查爾酮可以顯著逆轉順鉑誘導的HK-2細胞凋亡。

2.3 甘草查爾酮A對順鉑致HK-2細胞凋亡相關基因表達量的影響：與對照組比較，順鉑組caspase-3、caspase-8和caspase-9的mRNA水平顯著增高(P<0.05)；與順鉑組比較，甘草查爾酮A+順鉑合用組的caspase-3、caspase-8和caspase-9的mRNA表達均出現(xiàn)了顯著性下降(P< 0.05)，見圖3(目錄后)。

3 討論

腎近端小管是順鉑腎毒性損傷的主要部位[2]。由于體內環(huán)境復雜，動物實驗很難確定腎損傷的確切機制，因此體外培養(yǎng)模型逐漸應用于藥物腎毒性的評價、優(yōu)化篩選及機制研究中。HK-2細胞是成人腎近端小管上皮細胞，可永生化傳代，功能更接近原代培養(yǎng)細胞，已成為研究各種藥物腎毒性及腎小管損傷機制的重要細胞模型[9]。近年來有越來越多的中藥被證明可以預防或治療順鉑急性腎損傷[10-13]。甘草查爾酮A是甘草的主要活性成分之一，有較為廣泛的藥理活性，包括抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗寄生蟲等[5,14]。本研究中，甘草查爾酮A顯著降低了順鉑造成的HK-2細胞增殖抑制，說明其具有一定的保護作用。

順鉑腎毒性的主要機制包括DNA損傷、內質網(wǎng)應激和線粒體功能障礙、凋亡、氧化應激和炎癥等[2]。其中，凋亡是腎小管細胞的主要死亡方式之一。本研究表明，甘草查爾酮A顯著降低了順鉑造成的HK-2細胞凋亡。文獻報道[2,3,15]，順鉑不僅能調控線粒體依賴凋亡途徑(又稱內在途徑)，也能啟動死亡受體介導的外源性凋亡，引起腎毒性。內在途徑由細胞應激(例如 DNA 損傷)啟動，通過調控的p53、Bcl-2、Bax等線粒體凋亡信號分子的表達，使線粒體膜通透性增加，導致細胞色素C從線粒體釋放，通過與凋亡促進激活因子-1 (APAF-1) 的相互作用，從而激活caspase-9，并進一步激活效應子caspase-3、caspase-6及caspase-7等引起細胞凋亡。外源性細胞凋亡途徑是指也可以通過調控細胞膜上的腫瘤壞死因子受體(TNFR1)，上調Fas / Fas-L系統(tǒng)表達，并激活caspase-8，通過直接激活caspase-3或裂解BID為更短的tBID誘導Bak形成寡聚體激活細胞凋亡。本研究中甘草查爾酮A顯著降低了順鉑誘導的caspase-3、caspase-8、caspase-9的mRNA水平的升高，提示甘草查爾酮A不僅能通過線粒體依賴的內在凋亡途徑，還通通過死亡受體依賴的外在凋亡途徑緩解順鉑對HK-2細胞的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，順鉑引發(fā)的腎小管細胞凋亡與細胞氧化應激、亞硝化應激有關[2-4]。甘草查爾酮A是否通過氧化應激發(fā)揮保護作用值得進一步研究。

總之，本研究以HK-2細胞為體外模型，證明了甘草查爾酮A可以減輕順鉑所造成的人腎小管上皮細胞HK-2的生長抑制、凋亡增多，同時也發(fā)現(xiàn)甘草查爾酮A對順鉑參與的內在和外在凋亡途徑都有調控作用，說明甘草查爾酮A對順鉑致傷的HK-2細胞有一定保護作用，為順鉑的治療提供了新的策略。