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    耐鹽基因Hal1的克隆及表達載體的構(gòu)建

    2009-07-29 07:11:32陳宇光
    現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 2009年7期
    關(guān)鍵詞:耐鹽性克隆

    沈 雁 陳 霞 陳 燕 龔 毅 陳宇光

    摘要 以酵母菌株BWG1-7A基因組DNA為模板,利用PCR方法,擴增出耐鹽基因Hal1,測序表明該基因全長為885個核苷酸,與已發(fā)表的序列NC_001148比較,同源性99.3%。將該基因插入表達載體pYES2的BamHI和EcoRI酶切位點之間,構(gòu)建表達載體pYES2-Hal1,序列測定完全正確,為植物表達載體的構(gòu)建打下基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞 耐鹽性;Hal1基因;克隆

    中圖分類號 Q785 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739(2009)07-0243-02

    Cloning of Hal1 gene and construction of its expression plasmid

    SHEN Yan1,2 CHEN Xia1 CHEN Yan GONG Yi 1 * CHEN Yu-guang 2

    (1 Research Center of Biotechnology Shanghai Institutes for Biological Sciences the chinese Academy of Sciences,Shanghai 200233;

    2 School of life Sciences,Shanghai University)

    Abstract Taking Saccharomyces cerevisiae BWG1-7A genomic DNA as template,Hal1 gene is amplified by PCR. The amplified product was digested with BamHI and EcoRI enzymes,then ligated into pYES2 vector. The recombinant pYES-Hal1 was successfully constructed and verified by DNA sequence,which provided a foundation of the construction of plant expression vector.

    Key words Salt tolerance;Hal1 gene;Cloning

    隨著全球水資源危機以及土壤鹽化問題的加劇,鹽脅迫已經(jīng)成為影響植物生長、導(dǎo)致糧食和經(jīng)濟作物減產(chǎn)的主要限制因素[1]。目前,全世界大約有20%的農(nóng)業(yè)用地的鹽堿化程度在不斷加重,預(yù)計到2050年,將會有超過50%的耕地會變得鹽堿化[2]。在當前世界人口急劇增長、食品供給增長相對緩慢的情形下,只有采取一定的措施應(yīng)對日趨嚴重的環(huán)境壓力,才能確保人類的食品安全,維持農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。為了達到這一目標,就必須了解鹽脅迫對植物生長發(fā)育的影響,弄清植物耐鹽的機制,并通過農(nóng)業(yè)和生物技術(shù)手段改良農(nóng)作物,以增強它們的耐鹽性,使其最終為人類的生產(chǎn)和生活服務(wù)。耐鹽基因Hal1最初來源于啤酒酵母的第16號染色體,具有提高細胞中K+含量,降低Na+含量,也就是提高K+/Na+的比率[3,4],從而可以提高細胞耐鹽性的作用。本研究成功克隆了耐鹽基因Hal1,并將它連接到pYES2表達載體上,測序表明其與已發(fā)表的序列比較,同源性99.3%,構(gòu)建重組質(zhì)粒pYES2-Hal1,序列測定完全正確,為下一步利用該基因提高生物的耐鹽水平提供了技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    釀酒酵母BWG1-7A,大腸桿菌菌株DH5α,JM109,質(zhì)粒pYES2均為中科院上海生命科學(xué)研究院實驗室保存;KOD酶購自TOYOBO公司,T4連接酶、BamHI和EcoRI酶購自TaKaRa公司;質(zhì)粒抽提試劑盒,膠回收試劑盒購自上海申能博彩生物科技有限公司;引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成;其他化學(xué)試劑購自上海生工公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 酵母基因組DNA的提取。將活化的菌種接種于YPD培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),收集菌體后用Lyticase 酶解酵母細胞壁獲得原生質(zhì)體,參照亞當斯A等[5]采用SDS裂解酵母細胞,提取酵母基因組總DNA。

    1.2.2 Hal1基因的擴增。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中Hal1基因序列信息(序列登記號:NC_001148),用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計PCR引物,上游引物(P1)為5′-CGCGGATCCAT GCATTTCAAAGATTTAGGATTGCATACTACACTC-3′, 下游引物(P2)為5′-CCGGGAATTCTCAACTATTCTGT GTTG-3′,下劃線分別代表BamHI和EcoRI酶切位點。在20μL PCR反應(yīng)體系中加入模板DNA 1μL,10×反應(yīng)緩沖液2μL,2.5 mmoL/L dNTP 1μL,P1和P2引物均為5μmoL/L,KOD酶0.5IU,94℃預(yù)變性5min后,進行PCR循環(huán)。循環(huán)參數(shù)為:94℃變性50s,53℃退火45s,72℃延伸1min,30個循環(huán)后72℃延伸10min。

    1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定。將Hal1基因的PCR產(chǎn)物和pYES2載體經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切,酶切產(chǎn)物分別回收,以1∶3比例連接,轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞,涂布于氨芐平板上。隨機挑取3個菌落(1,2,3),擴大培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒,酶切鑒定后測序鑒定,重組質(zhì)粒命名為pYES2-Hal1。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Hal1基因的PCR擴增

    利用引物(P1,P2),以釀酒酵母基因組總DNA為模板,經(jīng)PCR擴增得到了1條900bp左右的單一條帶,與預(yù)期結(jié)果一致(見圖1)。

    2.2 Hal1基因的克隆

    將上述PCR產(chǎn)物酶切回收與pYES2連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。將隨機挑取的菌落擴增后提取質(zhì)粒,用BamHI和EcoRI進行酶切鑒定,第3號克隆酶切后電泳得到約900bp大小的片斷(見圖2)。

    2.3 重組質(zhì)粒pYES2-Hal1序列測定

    進而將3號克隆測序,結(jié)果顯示,該核苷酸序列與Genbank數(shù)據(jù)庫已報道的序列相比,同源性為99.3%(見圖3)。

    3 結(jié)論與討論

    釀酒酵母BWG1-7A具有較強的耐鹽能力,可在含有7%NaCl的YPD培養(yǎng)基中生長。本試驗通過PCR技術(shù),成功地從其DNA中克隆到耐鹽基因Hal1。測定的陽性克隆序列,與GenBank上公布的Hal1基因相比較,其核苷酸同源性為99.3%。與已發(fā)表的序列同源,將為Hal1基因植物表達載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化提供有力保障。

    酵母菌的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因表達和調(diào)控過程等都與高等生物具有一致性,因此已將其作為一種研究農(nóng)作物耐鹽機制的模式生物得到廣泛應(yīng)用[6]。本研究采用的釀酒酵母,是分離耐鹽基因的有效模型,有助于高等植物耐鹽分子機理的研究,推動抗?jié)B透脅迫工程的發(fā)展。

    鹽堿地是巨大的潛在資源,綠化鹽堿地是擴大耕地面積,進一步發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、改善生態(tài)環(huán)境的重要措施。利用基因工程手段培育能在鹽堿地上種植的林木,是利用鹽堿地的一條經(jīng)濟而有效的途徑。釀酒酵母Hal1基因在鹽脅迫下能與促進Na+外排的ENA1基因及其他轉(zhuǎn)運系統(tǒng)協(xié)同作用保持細胞內(nèi)低的Na+/K+比,以減輕Na+毒害,因而在植物耐鹽基因工程上具有很大的潛力[3]。

    4 參考文獻

    [1] 周和平,張立新,禹鋒,等.我國鹽堿地改良技術(shù)綜述及展望[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2007(11):159-164.

    [2]V INOCUR B,ALTMAN A. Recent advances in engineering p lant tolerance to a biotic stress: achievements and lim-itations[J].Current Opinion in Biotech-nology,2005(16):123-132.

    [3] R GAXIOLA,IF DE LARRINOA,JM Villalba,et al.A novel and conserved salt-induced protein is an important determinant of salt tolerance in yeast[J].EMBO,1992,11(9):3157-3164.

    [4] MARQUEZ JA,SERRANO R.Multiple transduction pathways regulate the sodium-extrusion gene PMR2/ENA1 during salt stress in yeast[J]. FEBS letters,1996(382):89-92.

    [5] 亞當斯A,戈特施林D E,凱澤C A. 酵母遺傳學(xué)方法實驗指南[M].劉子鐸,譯.北京:科學(xué)出版社,1998.

    [6] BORDAS M,MONTESINOS C,DABAUZA M,et al. T ransfer of the yeast salt to lerance gene HAL 1 to cucum isme cultivars and in vitro evaluation of salt tolerance[J].Transgenic Res,1997,6(1):41-50.

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