羅非魚血液和肌肉中土霉素萃取方法的研究

王偉利　段建偉　羅　理　姜　蘭　鄒為民

摘要通過HPLC方法對土霉素對照品進樣分析，繪制了土霉素的標準曲線，線性方程為y=355 00 x+238，檢測限為0.002 5μg/mL，定量限為0.005μg/mL，在0.005~10.000μg/mL之間線性關系良好，相關系數(shù)R=1.000 0。使用乙酸乙酯和不同體積高氯酸萃取，發(fā)現(xiàn)：使用乙酸乙酯萃取效率略低于5%高氯酸，但因為沸點低易于濃縮的優(yōu)勢，在滿足試驗要求的前提下可以考慮使用乙酸乙酯萃??；對于血液和肌肉中土霉素的萃取，考慮時間和試劑消耗，10mL的5%高氯酸1次萃取即可滿足一般檢測需求。

關鍵詞土霉素；回收率；變異系數(shù)；固相萃取

中圖分類號X836文獻標識碼A文章編號1007-5739（2009）07-0203-02

土霉素是四環(huán)素類藥物，作用機制是通過與核糖體30s亞基的特異性結(jié)合，抑制肽鏈延長和蛋白質(zhì)合成；抗菌譜廣，對革蘭氏陽性和陰性細菌均有抑制作用。近年來，由于耐藥性嚴重，已經(jīng)減少了其在生產(chǎn)、臨床上的使用。由于土霉素在可食性產(chǎn)品中的殘留會對骨骼和牙齒產(chǎn)生不可逆的色素沉著等不良影響。因此，控制土霉素的使用，實施對動物性食品中土霉素及有害代謝產(chǎn)物殘留的檢測十分重要。世界糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織、歐盟及我國政府對魚肉中土霉素的殘留都做出了嚴格的規(guī)定，其殘留限量不得高于0.1mg/kg。

有關土霉素的藥代動力學方面的研究已經(jīng)見有很多報道，多數(shù)通過0.5%~5.0%高氯酸萃取和固相萃取小柱進行凈化處理，但是由于高氯酸難以濃縮，使用固相萃取小柱凈化、有機溶劑洗脫，雖然易于濃縮，但成本較高。

本試驗以羅非魚為研究對象，通過比較乙酸乙酯和高氯酸對土霉素的萃取效果、不同劑量高氯酸萃取回收率、高氯酸對組織中土霉素的回收率及固相萃取中不同溶劑洗脫雜質(zhì)的回收效果等，以期對于水產(chǎn)動物組織中土霉素萃取方法的選擇提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1儀器。Water 2695高效液相色譜儀、2487紫外檢測器，SUPELCO VISIPREP 24TM DL固相萃取儀，美國Orga-nomation N-EVAPTM 112氮吹濃縮儀，德國IKA T18勻漿機，SIGMA 3K158離心機，瑞士METTLER TOLEDO的pH計和分析天平，太倉市科教器材廠VORTEX SHAKER WH-861型振蕩器。

1.1.2試劑。土霉素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號130487-200302，含量88.2%）；乙腈、甲醇、正己烷均為HPLC級；乙二胺四乙酸二鈉為超級純，MBCHEM公司產(chǎn)品；硝酸、乙酸乙酯、高氯酸、磷酸二氫鈉等均為分析純；Waters OASIS HLB 3cc/60mg固相萃取柱；試驗用羅非魚由珠江水產(chǎn)研究所基地提供。

1.1.3試劑的配制。土霉素儲備液：稱取土霉素對照品0.01g溶于100mL、pH值2.5、0.01moL的NaH2PO4，4℃保存，1個月內(nèi)有效；5%乙二胺四乙酸二鈉溶液：取5g的EDTA-2Na用蒸餾水定容至100mL；0.01moL的NaH2PO4：稱取1.56g的 NaH2PO4·2H2O溶于蒸餾水中，定容至1 000mL，以硝酸調(diào)節(jié)pH值至2.5，0.45μm濾膜過濾后備用。

1.2試驗方法

1.2.1液相色譜條件。根據(jù)水產(chǎn)品中土霉素殘留量的測定SC/T 3015-2002標準，略有調(diào)整；色譜柱：Waters Atlantis C18，5μm，4.6mm×150mm Column；檢測器：Waters 2487紫外檢測器；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；進樣量：20μL；流動相：乙腈-0.01moL磷酸二氫鈉溶液=26-74。

1.2.2標準曲線的繪制。將土霉素對照品儲備液稀釋至10 μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL、0.005μg/mL、0.002 5 μg/mL，按上述色譜條件進樣檢測。

1.2.3樣品準備。試驗用羅非魚10條（平均體重200±10g），經(jīng)檢測血液和肌肉中不含土霉素。采集血液使用0.1%的肝素鈉抗凝，準確定量均分至1mL/份；背部兩側(cè)肌肉去磷片、去皮，準確定量均分至1g/份。

1.2.4乙酸乙酯與高氯酸萃取回收率比較。取血液2份，分別加入1μg/mL土霉素對照品，回旋振蕩器振蕩5min；分別用1mL的5%高氯酸和1mL乙酸乙酯萃取，方法如下：勻漿30s；振蕩3min；5 000rpm 離心5min；取上清液0.45μm濾膜過濾后上樣檢測。

1.2.5不同劑量萃取劑回收率比較。分別取血液和肌肉各4份，血液和肌肉各取1份作為空白對照，其余分別加入土霉素1μg；用5%高氯酸1mL、10mL和10mL（2次）萃取回收檢測。

1.2.6固相萃取不同溶劑洗脫雜質(zhì)回收效果比較。取血液2份，分別添加1μg、0.1μg的土霉素，使用10mL的5%高氯酸萃取，Waters Oasis HLB固相萃取小柱凈化。洗脫雜質(zhì)程序中，分別采用5%甲醇水和ddH2O洗脫，計算相對回收率。固相萃取程序如下：①依次用3mL甲醇、2mL的5%EDTA-2 Na、3mL的ddH2O平衡萃取柱；②萃取液過柱；③用5mL的5%甲醇水洗脫雜質(zhì)或者ddH2O洗脫雜質(zhì)；④負壓下抽干2min；⑤5mL甲醇洗脫樣品；⑥氮吹儀40℃水浴吹干，pH值2.5的0.01moL的NaH2PO4定容至1mL；⑦振蕩器振蕩1min，液相檢測。

2結(jié)果與分析

2.1標準曲線與回歸方程

土霉素標準工作液在0.005~10.000μg/mL之間線性關系良好，檢測限達0.002 5μg/mL，定量限為0.005μg/mL，線性方程為y=35 500x+238，線性相關系數(shù)R=1.000 0（見圖1）。

2.2乙酸乙酯與5%高氯酸萃取效果比較

乙酸乙酯和高氯酸的回收率分別為50.3%、58.3%。高氯酸萃取回收率較乙酸乙酯高；乙酸乙酯萃取雜質(zhì)較多，但均與土霉素峰形分離完全。由于乙酸乙酯沸點低（77.2℃），容易濃縮，故在滿足檢測要求的前提下，為了節(jié)約樣品濃縮處理時間，乙酸乙酯仍是個較好的選擇（見圖2）。

2.35%高氯酸不同劑量萃取效果比較

在增大萃取劑用量的情況下，萃取效率明顯提高，但是1∶10之后，繼續(xù)增大萃取劑用量，回收率提高不大。在試驗要求允許的情況下，為了節(jié)約試劑、時間及濃縮的方便，1∶10萃取較好（見表1）。

2.4固相萃取不同溶劑洗脫雜質(zhì)回收效果比較

5%的甲醇水洗脫雜質(zhì)回收率明顯低于ddH2O效果，表明5%甲醇水會洗脫少量被分析物土霉素；同時隨著樣品中土霉素含量的提高，洗脫的比例也增加（見表2）。

3討論

（1）乙酸乙酯為低沸點的有機溶劑，常用于血液等組織中痕量物質(zhì)的回收處理。相對于常用的高氯酸和Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液萃取方法，乙酸乙酯具有回收率接近，易于濃縮的優(yōu)勢。

（2）國標SC/T 3015-2002方法中，5%高氯酸萃取后，使用正己烷去除樣品中的脂質(zhì)。本試驗過程中經(jīng)過比較，發(fā)現(xiàn)對于血液等脂肪含量少的組織，不進行除脂步驟不影響后期檢測。

（3）土霉素的固相萃取方法多使用C18或HLB固相萃取小柱進行，均達到較好效果，其中HLB小柱的回收率及穩(wěn)定性優(yōu)于C18。在凈化過程中，文獻中多使用5%甲醇水或ddH2O洗脫雜質(zhì)，其中Waters HLB推薦用法為5%甲醇水。本研究使用Waters HLB小柱凈化回收，發(fā)現(xiàn)使用ddH2O洗脫雜質(zhì)對土霉素的回收率在高中低（10μg、1μg、0.1μg）3個濃度加標量土霉素的回收率均在90%左右，高濃度回收率更達98.1%，明顯高于5%甲醇水洗脫雜質(zhì)。

4參考文獻

[1] 李薇，閻震.動物肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留量測定方法的探討[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2001，11（6）：730-731.

[2] 秦燕，陳毓芳，朱柳明.動物肌肉中四環(huán)素族藥物多殘留的固相萃取-酶聯(lián)免疫分析[J].中山大學學報（自然科學版），2004，43（1）：84-86.

[3] 岳振峰，鄭衛(wèi)平，謝麗琪，等.高效液相色譜法測定動物組織中四環(huán)素類抗生素殘留量的研究[J].分析試驗室，2006（10）：24-28.

[4] 潘維平，李大巖，邢立新，等.吉林省市售動物組織中抗生素殘留量的調(diào)查分析[J].華南預防醫(yī)學，2004（6）：63-64.

[5] 陳毓芳.肌肉組織中四環(huán)素類抗生素的固相萃取—液相色譜法測定 [J].分析測試學報，2003（3）：97-99.