微生物致病菌快速檢測技術(shù)

張華鋒

摘要:從原理、特點(diǎn)及應(yīng)用等方面對食源性微生物致病菌的免疫及分子檢測新技術(shù)作一概述,期望為致病菌監(jiān)測提供參考。

關(guān)鍵詞:致病菌免疫學(xué)聚合酶鏈反應(yīng)基因芯片

食品中的生物性污染無論是在發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家都是影響食品安全的最主要原因,致病性微生物是對消費(fèi)者健康危害最大的食品安全問題。要確定食源性微生物致病菌在食物鏈中相關(guān)的食品,尋找預(yù)防食品污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)則依賴于對致病菌的監(jiān)測能力和水平。

傳統(tǒng)的檢測方法無法對難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的致病菌進(jìn)行檢測,而且耗時(shí)費(fèi)力,獲得結(jié)果通常需要幾天的時(shí)間,不能實(shí)現(xiàn)有效的監(jiān)測、預(yù)防作用。因此,發(fā)展新的快速檢測與鑒定食源性致病菌的方法是及時(shí)有效地控制和預(yù)防致病菌傳播的前提。本文從原理、特點(diǎn)及應(yīng)用等方面對食源性致病菌的免疫學(xué)及聚合酶鏈反應(yīng)、基因芯片等檢測新技術(shù)進(jìn)行綜述。

1. 免疫學(xué)檢測技術(shù)

免疫學(xué)檢測技術(shù)將抗原、抗體反應(yīng)的特異性與酶的高效催化作用相結(jié)合,是一種可以定位、定性和定量的綜合技術(shù),具高專一性和高敏感度。

1.1 酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)。1971年Engvall建立了ELISA方法,它以酶或者輔酶作為標(biāo)記物,標(biāo)記抗原或者抗體,用酶促反應(yīng)的放大作用來顯示初級免疫學(xué)反應(yīng),并且利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板(或球)吸附抗原或者抗體,使其固相化,在其中進(jìn)行免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)。ELISA具有選擇性好、結(jié)果判斷客觀準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)、樣品處理量大等優(yōu)點(diǎn),彌補(bǔ)了經(jīng)典化學(xué)分析方法和其他儀器測試手段的不足。但ELISA對試劑的選擇性高,很難同時(shí)分析多成分;對結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng);對分析分子量很小的化合物或很不穩(wěn)定的化合物有一定的困難。

1.2 免疫磁性分離技術(shù)。免疫磁性分離技術(shù)是將特異性抗體偶聯(lián)在磁性顆粒表面,與樣品中被檢致病菌發(fā)生特異性的結(jié)合,載有致病菌的磁性顆粒在外加磁場的作用下,向磁極方向聚集,棄去檢樣混合液,使致病菌不斷得到分離、濃縮。免疫磁性分離技術(shù)代替了常規(guī)的選擇性增菌培養(yǎng)過程,可特異有效地將目的微生物從樣品中快速的分離出來。

1.3 免疫膠體金技術(shù)。免疫膠體金技術(shù)起源于1971年Faulk等應(yīng)用電鏡免疫膠體金染色法(IGS)觀察沙門氏菌。其基本原理是以微孔濾膜為載體包被已知抗原或抗體,加入待檢標(biāo)本后,經(jīng)濾膜的毛細(xì)管作用或滲濾作用使標(biāo)本中的抗原或抗體與膜上包被的抗體或抗原結(jié)合,再用膠體金結(jié)合物標(biāo)記而達(dá)到檢測目的。其特點(diǎn)是單份測定、簡單快速、特異敏感、不需任何儀器設(shè)備和試劑,幾分鐘就可用肉眼觀察到顏色鮮明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并可保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2. 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測方法

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是近十多年來應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)方法,在食源性致病菌的檢測中均是以其遺傳物質(zhì)高度保守的核酸序列設(shè)計(jì)特 異引物進(jìn)行擴(kuò)增,進(jìn)而用凝膠電泳和紫外核酸檢測儀觀察擴(kuò)增結(jié)果。其中,依賴PCR的DNA指紋圖譜技術(shù)、多重PCR檢測技術(shù)(m.PCR)、定量PCR檢測技術(shù)等應(yīng)用最為廣泛。

2.1 依賴PCR的DNA指紋圖譜技術(shù)。依賴PCR的DNA指紋圖譜技術(shù)是通過各種改進(jìn)的PCR技術(shù),使目標(biāo)微生物的核酸經(jīng)擴(kuò)增后,產(chǎn)生多條DNA擴(kuò)增片段(特異性和非特異性的),通過統(tǒng)計(jì)分析,找出某種微生物的特有條帶,進(jìn)行區(qū)別鑒定。

2.1.1隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA多態(tài) (RAPD)。隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA多態(tài)性主要用于不考慮微生物核酸精確序列的情況下,比較微生物間的DNA指紋圖譜差異,用于細(xì)菌種問的鑒定,Black等[8]將毛細(xì)管熱循環(huán)儀及RAPD技術(shù)用于李斯特氏菌(Listeria Pirie)的鑒定,3h即可出結(jié)果。Louie等比較了核酸分型技術(shù)、RAPD和脈沖場凝膠電泳技術(shù),用于李斯特菌的分型鑒定,結(jié)果顯示后兩種方法效果較好。但是RAPD的不足之處是需對大量的隨機(jī)引物進(jìn)行篩選,且有時(shí)擴(kuò)增的條帶不很穩(wěn)定。

2.1.2 基因內(nèi)重復(fù)性一致序(ERIC)的擴(kuò)增。ERIC片段是存在于腸道細(xì)菌核酸中的重復(fù)DNA序列,長126bp,含有一段高度保守的中心反轉(zhuǎn)重復(fù)序列,分布在細(xì)菌染色體的不同位點(diǎn)上且以不同的距離分隔,因此,以這些重復(fù)的DNA片段作為PCR擴(kuò)增時(shí)引物的結(jié)合位點(diǎn),使其被分隔的片段大量擴(kuò)增,在凝膠電泳上形成一系列的條帶,從而區(qū)分不同的腸道細(xì)菌。Versalovio等[10]曾用與ERIC重復(fù)序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段作為引物及斑點(diǎn)雜交DNA探針來檢測包括大腸桿菌(E.coli)、沙門氏菌(Salmonella)、志賀氏菌(Shigella)等不同菌種間存在的特異DNA指紋圖譜。與RAPD相比,此法引用的引物序列固定,結(jié)果的重復(fù)性更好。

2.2 多重PCR檢測技術(shù)(m-PCR)。PCR技術(shù)已經(jīng)運(yùn)用于食品中單一致病菌的檢測, 并得到一定程度的推廣,但食品中往往含有多種致病菌。多重PCR的建立,實(shí)現(xiàn)了多種食源性致病菌的同時(shí)檢測。M.PCR是指在同一個(gè)反應(yīng)體系中,加入多對特異性引物,如果存在與各引物對特異性互補(bǔ)的模板,即可同時(shí)在同一反應(yīng)管中擴(kuò)增出一條以上的目的DNA片段,實(shí)現(xiàn)了一次性檢測多種致病菌的目的。

我國學(xué)者嚴(yán)笠等[13]應(yīng)用m.PCR,在同一擴(kuò)增體系中同時(shí)擴(kuò)增了大腸埃希氏菌O157:H7(Escherichia coli 0157:H7)、沙門氏菌(Salmonella spp.)和志賀氏菌(Shigella spp.)特征性基因,最后通過凝膠電泳實(shí)現(xiàn)了這三種致病菌的的同時(shí)快速檢測,取得理想結(jié)果。m.PCR既保留了常規(guī)PCR的特異性、敏感性,又減少了操作步驟及試劑。但也存在較明顯的不足:擴(kuò)增效率不高、敏感性偏低;擴(kuò)增條件需摸索與協(xié)調(diào);可能出現(xiàn)引物間干擾等。

2.3 定量PCR檢測技術(shù)。定量PCR檢測技術(shù)是對傳統(tǒng)定性PCR技術(shù)的發(fā)展和補(bǔ)充,即在PCR反應(yīng)體系中加入標(biāo)記物,通過標(biāo)記物的表達(dá)量,在定性的同時(shí)實(shí)現(xiàn)定量。

2.3.1 內(nèi)標(biāo)定量PCR。內(nèi)標(biāo)定量PCR采用終點(diǎn)檢測,即PCR到達(dá)平臺期后進(jìn)行檢測,建立常規(guī)PCR經(jīng)過對數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺期時(shí),檢測重顯性極差。因此,無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量,而加入內(nèi)標(biāo)后,可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性,達(dá)到定量。

2.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)無須內(nèi)標(biāo)物,而是在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法,有效地解決了內(nèi)標(biāo)定量PCR只能終點(diǎn)檢測的局限,實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個(gè)樣品Ct值(每個(gè)反應(yīng)內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),Cycle threshold)計(jì)算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得定量結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光定量PCR將DNA擴(kuò)增和分子雜交同步進(jìn)行,且采用了閉管檢測,擴(kuò)增后無須電泳,自動(dòng)化程度高,減少了污染的可能性,提高了檢測的靈敏度和特異性。

3. 基因芯片技術(shù)

基因芯片(gene chip)是指按照預(yù)定位置固定在固相載體上很小面積內(nèi)的千萬個(gè)核酸分子所組成的微點(diǎn)陣列。其檢測致病菌原理為:相關(guān)細(xì)菌的特異性基因(如毒力基因、抗生素耐受基因) 和基因庫中的rDNA序列設(shè)計(jì)玻片上的片斷,這種方法可以快速、準(zhǔn)確地檢測和鑒定食物中的病原菌。

唐曉敏等利用此技術(shù)檢測水中常見致病菌,與傳統(tǒng)方法鑒定結(jié)果一致性為95%,并且對于一個(gè)未知菌落,可以在4h之內(nèi)完成菌種判斷,為快速檢測與鑒定常見致病菌提供了有效的手段。

4. 討論

免疫學(xué)方法,不需復(fù)雜儀器,所需設(shè)備簡單、易操作。其中免疫膠體金快速診斷技術(shù)由于其無污染、便捷、靈敏、安全等特點(diǎn)逐漸有取代ELlSA等的檢測方法的趨勢,對致病菌的檢測有著相當(dāng)大的應(yīng)用前景。但免疫學(xué)方法一般需提供數(shù)量較多的純化細(xì)菌,或需對樣品進(jìn)行濃縮后收集,以提高單位體積的含菌量,從而較難在短時(shí)間內(nèi)得到檢測結(jié)果。許多快速檢測方法,在應(yīng)用過程中有其所長和不足?？傮w來看,快速檢測方法在衛(wèi)生檢驗(yàn)方面目前尚存在有時(shí)定性與精確定量難以兼顧狀況。另外,每一種免疫學(xué)檢測模式都存在抗體與非抗原物質(zhì)之間的非特異性反應(yīng),如檢測中特異性抗體與細(xì)菌增菌液、培養(yǎng)過濾物(含葡萄球菌A/G蛋白)或食品中某些成分(如溶菌酶E、單寧物質(zhì)等)的結(jié)合,從而產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。此外,待檢抗原被樣品中一些物質(zhì)或其它優(yōu)勢菌群所掩蔽,會(huì)產(chǎn)生假陰性反應(yīng)。為了避免這些誤差,可設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。通常,可用合成肽或抗獨(dú)特型抗體特異阻斷IgG或用單抗特異性阻斷的方法減少假陽性;針對假陰性結(jié)果可以加入定量抗原到樣品中,以國際標(biāo)準(zhǔn)抗原樣品為準(zhǔn),進(jìn)行對照,以此減少假陰性結(jié)果。在致病菌的分子生物學(xué)檢測方法方面,由于檢樣中存在死的致病菌、特異性DNA或RNA片段存在同源性和檢樣中存在不可培養(yǎng)微生物的情況等問題,常常造成PCR檢測結(jié)果與常規(guī)方法相比,陽性率變高的現(xiàn)象,除存在不可培養(yǎng)微生物的情況外,均屬于假陽性范疇,然而對假陽性問題,通常在實(shí)際食品檢測工作中,PCR檢測技術(shù)可作為大通量的快速檢測技術(shù),對其中出現(xiàn)的極少數(shù)的陽性樣品,可采用傳統(tǒng)的方法加以印證,即可解決假陽性的問題。另外,非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)、引物二聚體的形成、甚至凝膠電泳上無擴(kuò)增帶,只出現(xiàn)一片模糊,也限制了PCR技術(shù)的應(yīng)用,針對這些問題,結(jié)合熱啟動(dòng)PCR和降落PCR有望進(jìn)一步得到改進(jìn)。目前,分子生物學(xué)方法是食源性致病菌檢測方法的主要發(fā)展方向,尤其是DNA指紋圖譜技術(shù)近年來得到快速發(fā)展。對于一種未知菌, 為了提高致病菌檢出率、縮短檢測時(shí)間、簡化檢測程序,一般先采用通用引物多重PCR技術(shù)鑒定出種、屬,再用DNA指紋圖譜技術(shù)進(jìn)一步分型。而將生物芯片技術(shù)或多重PCR與熒光探針定量技術(shù)相結(jié)合,形成一套完整分子生物學(xué)方法,可使致病菌的檢測逐步向靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性大、簡易、經(jīng)濟(jì)的方向不斷發(fā)展。

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