轉基因技術在動物遺傳改良上的應用進展

劉中華　王華巖　喬憲鳳　鄭新民

摘要：簡要介紹了幾種比較常用的轉基因方法，包括顯微注射法、脂質體介導法、電轉染法、胚胎干細胞法、病毒載體法、精于載體法、卵巢直接注射法。傳統(tǒng)的轉基因方法與基因打靶、體細胞核移植、RNA干擾以及線粒體轉移技術相結合，在基因功能研究和疾病治療中發(fā)揮越來越重要的作用。特別是近年來在植物上出現(xiàn)的外源基因清除技術，為我們在動物上徹底去除外源基因的影響提供了新思路。

關鍵詞：轉基因技術；動物；外源基因：遺傳改良

中圖分類號：Q812；S813 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(2009)02-0481-06

動物轉基因技術是將外源基因導入人或動物細胞內，使外源性基因整合在染色體基因組上并穩(wěn)定的傳給下一代。1976年。Jaenisch等利用反轉錄病毒感染胚胎的方法進行基因轉移，這是最早的動物轉基因方法的應用。隨后各國研究者相繼在小鼠、大鼠、兔、綿羊、豬、山羊、雞、蛙、魚類等動物上獲得成功，使用的方法也不盡相同，包括顯微注射法、脂質體介導法、電轉染法、病毒載體法、精子載體法等。傳統(tǒng)的轉基因方法與前沿的生物學技術如基因打靶、體細胞核移植、RNA干擾等相結合，越來越顯示了其強大的生命力。隨著轉基因動物技術的發(fā)展，轉基因產品已經廣泛滲透到醫(yī)療、衛(wèi)生、農產品和食品等中。

1動物轉基因技術

1．1顯微注射法

顯微注射法(microiniection)是指通過顯微操作儀將外源基因注入受體動物受精卵的細胞核中，外源基因整合到受體細胞染色體上，發(fā)育成轉基因動物的技術。1980年，Gordon等L2)利用顯微注射的方法將構建的HSV-Tx融合基因轉入小鼠的基因組，在得到的78只仔鼠中有2只為轉基因動物。1982，Palmiter等L3)應用顯微注射技術成功地將大鼠的生長激素基因注射到小鼠受精卵的雄原核中，獲得了整合并表達外源性生長激素的超級轉基因“碩鼠”。

顯微注射法是發(fā)展最早、使用最為廣泛也是最，為有效的轉基因方法之一。Zhu等利用顯微注射法生產出轉sFat-I基因小鼠。Tang等利用此法制備㈩乳腺中可表達重組抗CD 20抗體的轉基因小鼠、Manoi等將TAIL-PCR技術用于分析顯微注射導致的整合位點不確定中，進一步拓展了該方法的應用范圍。目前，利用此方法已成功的生產出了小鼠、兔、綿羊、豬、牛、魚和雞等各種轉基因動物。

1．2脂質體介導法

脂質體(liposome)特別是陽離子脂質體(cation-ic liposome)目前是實驗室進行轉基因研究的一種常規(guī)方法。該方法具有生產簡便、毒性低、無感染危險等優(yōu)點。有別于其他類型的脂質體，陽離子脂質并不將DNA包裹在其脂質雙分子層中，只需將二者直接混合即可得到一種穩(wěn)定的復合物——liooplexes，因此，復合物的形成不受DNA體積大小的限制。

1．3電轉染法

自Muramatsu等將電轉染(eleetroporation)應用于小鼠睪丸細胞獲得成功以來，電轉染目前已成為基因轉移的高效且常規(guī)的手段之一。董菊子等對轉染前孵育溫度、滲透壓、電轉染參數(shù)、細胞周期等對電轉染效率有影響的因素進行了系統(tǒng)研究，摸索出電轉染的合適條件。Umemoto等將pCA GGS-lacZ基因電轉染小鼠睪丸并設計了一系列對照，結果電轉染對小鼠后代的數(shù)量并無顯著影響。Nataeha等川在研究改進一種新的WISH方法時也使用了電轉染方法。

1．4胚胎干細胞法

胚胎干細胞(ESC)是從早期胚胎的內細胞團經過體外培養(yǎng)建立起來的多潛能細胞系，注射于動物囊胚后可參與宿主的胚胎形成嵌合體，直至達到種內嵌合，因此可將其作為一種載體，導入外源基因，獲得轉基因動物。Capeeehi等首先對小鼠ES細胞進行了基因打靶，然后將此打靶的ES細胞移植進入小鼠囊胚，將此重組胚移植進入代孕母鼠，最后產出嵌合體仔鼠，通過相互交配獲得基因敲除的純合小鼠。ES細胞介導技術是公認的研究基因轉移、基因定位整合的一類極有前途的實驗方法。此法可使受體動物細胞中基因整合率達到50％，其中生殖細胞整合率達30％。目前，胚胎干細胞介導法在小鼠上應用比較成熟，在大動物上應用較晚。

1．5病毒載體法

目前使用較多的是逆轉錄病毒感染法(retro-virus-mediated gene transfer)。該方法是利用逆轉錄病毒DNA的長末端重復序列(LTR)區(qū)域具有轉錄啟動子活性這一特點，將外源基因連接到LTR下部進行重組后，包裝成高滴度病毒顆粒，直接感染受精卵，或微注入囊胚腔中。攜帶外源基因的逆轉錄病毒DNA可以整合到宿主染色體上。1974年，Jaenish等將SV40 DNA注入小鼠囊胚腔中，發(fā)現(xiàn)獲得的小鼠體內有SV40 DNA整合。次年，他又成功地用鼠白血病病毒(MuLV)作為載體，將外源基因導入小鼠胚胎。1990年，Harvcy用貓白血病病毒作為載體，也成功地將外源基因導入去透明帶的羊胚胎中。目前，逆轉錄病毒載體已廣泛應用于各種動物的轉基因研究中。

另一種常用的是腺病毒感染法(adenovirus-mediated gene transfer)?？茖W研究者已經對這類載體進行了3次改造，使其在外源DNA裝載容量、安全性、外源基因表達的穩(wěn)定性和轉染效率等方面得到了很大提高。Matthias等利用腺病毒將轉化多能干細胞的4個必需基因轉染到小鼠的正常細胞內，腺病毒直接作用于蛋白質而不是染色體，不會改變宿主DNA，并且經過幾次分裂后就會被清除，因此不會對細胞產生危害。通過這種方法，研究者已經從大鼠皮膚細胞、胚胎肝細胞以及成熟肝細胞成功且安全地誘導出了多能干細胞。

總的來說。病毒介導的基因轉染效率高，可攜帶大片段的DNA進行轉移，但其靶向性和組織特異性差。生物危害比較大，可引起感染及炎癥反應，因此其應用受到一定程度的限制。

1．6精子載體法

早在1971年，Brackett等研究發(fā)現(xiàn)，兔精于和3H-胸腺嘧啶標記的SV40 DNA共溫育，在精子頭部的頂體后區(qū)可檢測到放射性物質存在，當這些精于和CV-1腎細胞融合后可以分離到具有感染性的SV40病毒，這些證據(jù)顯示兔精于具有吸附外源DNA的能力。1989年Lavitrano等首次利用小鼠附睪精于與DNA溫育產生轉基因小鼠，稱之為精于介導的轉基因法(SMGT)。Sato等通過直接注射外源DNA到小鼠睪丸內完成轉基因，發(fā)展了一種新的轉基因途徑，即睪丸介導的轉基因法(TMGT)。Sato等向小鼠睪丸內注射臺盼藍和Hoechst33342染料，發(fā)現(xiàn)這些染料1min內即可通過附睪頭導管傳遍睪丸網。Shen等直接向雄兔睪

丸內注射攜帶綠色熒光表達的外源DNA及二甲基亞楓的介質，使DNA能夠進入睪丸細胞和生精細胞，1個月后用處理的雄兔與雌兔交配，所產后代中56％的仔兔能高效地表達所導入的外源基因，Ko-jima等rD將攜帶報告基因LacZ的腺病毒載體直接注射到小鼠睪丸內，之后利用PCR、RT-PCR、免疫組化對其生殖系細胞和后代進行檢測，發(fā)現(xiàn)腺病毒載體只能感染非生殖細胞，不能傳給下一代，因而研究者可以將腺病毒介導的轉基因技術應用于體細胞功能障礙引起的雄性不育研究中。

1．7卵巢內直接注射

人們在研究利用精于作為載體進行動物轉基因同時，也試驗了雌性生殖系統(tǒng)轉基因的可行性、Gordon率先嘗試向小鼠卵巢內直接注射包含報告基因LacZ的腺病毒載體。結果表明腺病毒載體不能感染卵子，這種載體在雌性生殖系轉染效率是很低的。兩年后，Sato等將質粒DNA注射到小鼠卵巢中并進行體內電轉染，轉基因效率變化較大(8％～60％)。Yang等直接對小鼠的卵巢注射表達質粒plRES-EGFP，得到了轉基因小鼠，檢測后代的陽性率達54％，并且發(fā)現(xiàn)獲得的轉基因小鼠6代以內都具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

2動物轉基因技術的應用

2．1基因打靶與轉基因

基因打靶(cerie targeting)是基因同源重組技術的一種，就是利用同源重組的原理，用外源性DNA定點修飾改造染色體目的基因的方法，包括基因敲除(knock out)和基因敲入(knock in)技術。基因打靶實際上是轉基因學、同源重組和胚胎干細胞3種技術結合的產物。

Brown等成功地在人正常二倍體成纖維細胞中敲除了p21基因，揭示了p21與細胞衰老間的關系。Chan等在HC7116細胞系中成功敲除了14-3-3σ基因，證明該基因在DNA發(fā)生損傷后參與維持G2期檢驗點并阻止細胞死亡。但質粒載體轉入細胞及整合進特異位點的效率較低，增加了試驗的成本和操作的復雜性。重組腺相關病毒(rAAV)載體的出現(xiàn)在一定程度上克服了上述缺點。Topaloglu等分別利用質粒載體和腺病毒相關載體對人直腸癌細胞系p53基因進行打靶，結果顯示腺病毒相關載體打靶效率是質粒載體的25倍。人們在常規(guī)基因打靶的基礎上引入Cre/loxP系統(tǒng)，建立了一種可以在特定的發(fā)育階段和特定的組織細胞中開啟或關閉特定基因的時空特異性基因打靶(spatiotempo-ral gene targeting，STGT)技術。He等用Syn-Cre小鼠研究大腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)及其受體在癲癇發(fā)病中的作用，Lin等構建Ksp-Cre小鼠特異性地敲除腎臟上皮細胞纖毛蛋白KIF3A和轉錄因子HNF-1B，均采用了該技術。

2．2體細胞核移植與轉基因

利用基因工程技術將目的基因整合到動物體細胞染色體中，并將其作為供體核移植入受體(去核卵母細胞)構成重建胚，然后將其植入假孕母體，待其妊娠、分娩，便可得到經定向遺傳修飾的轉基因克隆動物。這其實是體細胞核移植技術與轉基因技術結合的產物。體細胞核移植技術路線所獲得的轉基因動物，其機體各組織細胞均源自于最初形成重構胚的體細胞核，理論上來說由其所形成的轉基因動物應該全身的各組織細胞都具有同供核細胞一樣的基因型，而通過其他途徑獲得的轉基因動物有時會出現(xiàn)嵌合基因。

國外很早就有這方面的報道，Lai等叫采用核移植技術生產出世界第一只綠色熒光蛋白轉基因豬。張運海等叫利用體細胞核移植技術生產出表達綠色熒光蛋白的豬轉基因克隆胚胎：東北農業(yè)大學生命科學學院劉忠華等以綠色熒光蛋白基因轉染后的陽性細胞作為體細胞核移植的核供體，以體外成熟卵母細胞為核受體，構建了綠色熒光蛋白轉基因克隆豬胚胎，并對重構胚在體外和體內發(fā)育情況以及綠色熒光蛋白表達情況進行了跟蹤研究，共出生克隆豬6頭，其中4頭為GFP陽性，表明我國科學家已經具備采用體細胞核移植技術路線制作轉基因豬的全部技術。

2．3RNA干擾與轉基因

RNA干擾(RNA interference)是雙鏈RNA介導的特異性基因沉默現(xiàn)象，是真核生物中普遍存在的古老而保守的自身防御機制和內源性基因表達調控機制，1998年Fire等C38，首次發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象，隨后RNA干擾的基礎和應用研究迅速成為21世紀初生命科學中的熱點領域。一直以來，基于同源重組的基因敲除技術是研究內源性基因功能缺失的主要手段，但其缺點是耗時費力，難度較大。近年發(fā)展的RNAi技術與轉基因技術相結合，通過抑制內源基因的表達或mRNA的降解，特異地、部分地和可逆地使目的基因表達下調沉默，從而實現(xiàn)基因調控的時空性和可逆性。

Paula等利用原核顯微注射法向小鼠卵子內導入卵子特異性啟動子Z03啟動的打靶Mos mR-NA的長雙鏈RNA，成功的生產出轉基因后代。Williams等針對睪丸特異性基因PLC-l設計shRNA，然后克隆進入載體，顯微注射人小鼠睪丸，克服了長期以來雄性生殖細胞體外難以培養(yǎng)的缺點。隨后研究者利用Cre/LoxP系統(tǒng)，已經開發(fā)出在時間和空間上可調控的RNA干擾技術。Diekins等將啟動子四環(huán)素反應元件(tetracyclin responseelement.TRE)與RNA干擾基因一起克隆進載體并轉入小鼠中，然后該小鼠與含有四環(huán)素轉錄激活因子的轉基因小鼠雜交，制備同時含有兩套元件的轉基因小鼠，就可以通過四環(huán)素藥物的投放來實現(xiàn)RNA干擾的可逆調控。因此利用RNAi制作降低或抑制某些基因或性狀的轉基因動物，將是一種非常奇妙和有前景的領域。

2．4線粒體與轉基因

由于大多數(shù)轉基因動物受遺傳鑲嵌性和雜合性的影響，其有性生殖后代變異很大，難以形成可穩(wěn)定遺傳的轉基因品系。線粒體是普遍存在于動植物細胞內的一種具有半自主性的細胞器，線粒體DNA呈雙鏈環(huán)狀，其遺傳主要表現(xiàn)為母性遺傳，雄性配子對受精卵mtDNA的貢獻不到0.01％。以線粒體作為轉基因載體，即先從受體動物細胞分離出線粒體，再用外源基因對這些線粒體進行離體遺傳轉化，然后把轉基因線粒體導入受體動物受精卵，那么由此發(fā)育而成的轉基因動物就避開了外源基因在染色體上難于整合及隨機插入等問題。

目前利用線粒體作為轉基因手段的研究還處于摸索階段。Ebert等將異源線粒體注射人小鼠胚胎，經過注射的胚胎移植后發(fā)育正常，但在出生的仔鼠中檢測不到異源線粒體。Pinkert等將從Mus spretus系小鼠肝細胞中分離到的活的線粒體顯微注射人原核期的M.Musculus系小鼠胚胎中，在注射的217枚胚胎中，67枚存活，其中23枚經4.5d的體外培養(yǎng)后發(fā)育到囊胚。巢式PCR檢測的結果表

明，經過顯微注射的M.Musculus系小鼠胚胎在體外培養(yǎng)時，無論是0.5d還是4.5d均能檢測到Musspretus系小鼠的線粒體。Irwin等將201枚經異源線粒體顯微注射的小鼠胚胎移植到假孕母鼠的輸卵管，在生出的93只仔鼠中有5只(3雄2雌)能檢測到異源線粒體。其中3只雄鼠與M.Musculus系雌小鼠交配，在出生的后代小鼠中(41只)無一例能檢測到異源線粒體。這是預料中的。兩只轉線粒體雌鼠中，一只能將異源線粒體傳遞給后代小鼠，另一只不能。線粒體也可以在不同物種間進行轉移，Sokolova等從人肝臟細胞中分離出線粒體，顯微注射到小鼠合子，再植入假孕母鼠體內發(fā)育，F(xiàn)代小鼠許多組織器官中檢測到了人體線粒體，Yi等將小鼠肝細胞分離的線粒體注射入小鼠受精卵后體外培養(yǎng)，囊胚形成率為37.65％，與未注射組20.91％相比，差異顯著，證明異源線粒體可促進小鼠胚胎發(fā)育。

上述研究表明動物個體之間進行線粒體轉移是可能的，但轉線粒體基因與轉核基因存在很多明顯的區(qū)別，這主要是由于核基因與線粒體基因表達特征決定的。外源mtDNA在宿主細胞中的存在形式有兩種可能，要么在核遺傳物質與線粒體遺傳物質轉移過程中，進入到宿主線粒體。與宿主mtDNA共存同一線粒體中：也有可能是外源線粒體DNA在宿主細胞中，重新組裝成為新的線粒體。這還有待進一步研究。

3外源基因清除技術

外源基因清除技術(Gene-Deletor)是美國康涅狄格大學華裔教授李義領導的研究小組發(fā)展起來的，有望成為解決轉基因植物環(huán)境安全性和食品安全性問題的有力工具。該技術綜合利用了兩套位點特異重組酶的元件，即來源于細菌噬菌體的Cre/LoxP系統(tǒng)和來自于酵母的FLP/FRT系統(tǒng)，這兩套系統(tǒng)均通過重組酶識別特定的重組位點將插入該位點間的所有外源基因刪除。Cre/LoxP和FLP/FRT系統(tǒng)已經分別用于刪除轉基因植物的篩選標記序列。外源基因清除技術綜合應用了兩套系統(tǒng)，創(chuàng)造了一個loxP和FRT的融合識別位點LF(LoxP-FRT)，獲得了一個高效基因清除系統(tǒng)。特異啟動子驅動重組酶FLP或者Cre在適當?shù)臅r間和部位表達，重組酶識別融合識別位點LF.兩個融合識別位點之間的序列(包括重組酶的基因序列)在特定的時期、從特定植物器官的細胞基因組中全部清除。與以前的相關技術相比，外源基因清除技術具有幾個顯著優(yōu)點：①能夠將轉基因植物花粉和種子中的外源基因全部清除。②大幅度地提高了轉基因植物中外源基因的刪除效率。實驗證明，在3萬多株轉基因煙草后代植株中，基因清除效率達到了100％。③外源基因清除技術更適合于生產上應用，尤其是在第二代(生產者和消費者都受益的性狀改良)和第三代(以轉基因植物作為生物反應器)基因工程產品生產中更有應用價值。Gu等首先提出了Cre/LoxP系統(tǒng)(包括Cre重組酶和loxP位點兩部分)。人們很早就在小鼠上應用Cre/LoxP系統(tǒng)進行研究。Carolyn等在小鼠上試驗后認為FLP/FRT系統(tǒng)是Cre/LoxP系統(tǒng)的一種有效的替代。我們當前面臨的任務是如何對Gene-Deletor技術進行一些改造。將其應用在動物上，這必將給動物轉基因技術帶來一些革命性改變。

4問題及展望

目前動物轉基因技術發(fā)展迅速，已經在鼠、豬、牛、羊、兔等多種動物上獲得成功。但還存在一系列問題制約著轉基因動物的生產規(guī)模，如轉入基因的內在作用機制研究的還不夠深入，轉基因動物制作效率還比較低，轉入的選擇標記性基因還沒辦法有效清除等等，這些都限制著轉基因動物產品的研究與開發(fā)。傳統(tǒng)的轉基因技術與新近出現(xiàn)的分子生物學研究手段相結合，豐富了轉基因研究領域。基因打靶技術和體細胞克隆技術的發(fā)展，為轉基因動物的制備提供了一個良好的平臺；基因打靶與RNA干擾結合轉基因技術，為獲得對于特定基因進行表達的可控、可逆等精細調控提供了新的途徑：線粒體做為轉基因載體，將避開外源基因在染色體上難于整合及隨機插入等問題：外源基因清除技術如果應用到動物上，就可以將轉入基因在發(fā)揮作用后及時清除掉。可以預見，隨著各種新的生物技術的出現(xiàn)和發(fā)展，轉基因技術必將變得更加快捷、方便、高效，能更好的用于制備各種新穎的轉基因動物，在動物新品種培育、醫(yī)學疾病模型研究和生物制藥等領域發(fā)揮更加重要的作用。

(責任編輯昌炎新)