人骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性的鑒定

唐欲博 陳孝 黃保丁 馮鑫 彭龍?jiān)?彭新生 鄒學(xué)農(nóng)

基礎(chǔ)研究

人骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性的鑒定

唐欲博 陳孝 黃保丁 馮鑫 彭龍?jiān)?彭新生 鄒學(xué)農(nóng)

目的建立人骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化與鑒定的方法，并探討其生物學(xué)特性。方法收集腰椎間盤(pán)退變性疾病患者的髂骨骨髓24例，密度梯度離心法分離的單個(gè)核細(xì)胞接種于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶，貼壁培養(yǎng)，EGM-2培養(yǎng)基誘導(dǎo)擴(kuò)增EPCs。Dil-ac-LDL、FITC-UEA-I熒光雙標(biāo)、流式細(xì)胞術(shù)鑒定EPCs，計(jì)算純度。透射電鏡和管腔形成實(shí)驗(yàn)鑒定EPCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）分化的能力。結(jié)果培養(yǎng)72 h換液時(shí)可見(jiàn)貼壁細(xì)胞形成明顯細(xì)胞克隆集落，第5天集落數(shù)增加，1周后細(xì)胞融合達(dá)80%，至第14天細(xì)胞呈鋪路石樣排列。培養(yǎng)至第7天細(xì)胞Dil-ac-LDL、FITC-UEA-I雙熒光染色陽(yáng)性率為（95.1±4.0）%，CD133、CD34、KDR、VE-Cadherin標(biāo)記陽(yáng)性率分別為（18.5±4.4）%、（45.4±7.8）%、（66.7±7.2）%、（20.5±5.3）%。培養(yǎng)第10天細(xì)胞透射電鏡顯示成熟血管ECs特有的Weibel-Palade小體。管腔形成實(shí)驗(yàn)表明，體外ECMatrix上培養(yǎng)7至12d的EPCs具有較強(qiáng)的管腔形成能力。結(jié)論采用密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)的人髂骨骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞在特定誘導(dǎo)條件下可分化為EPCs，純度較高，穩(wěn)定性和重復(fù)性好。EPCs培養(yǎng)7至12d，具有良好的管腔形成能力。

內(nèi)皮細(xì)胞；骨髓細(xì)胞；細(xì)胞，培養(yǎng)的；細(xì)胞分離

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）的前體細(xì)胞，是一群介于血液-血管細(xì)胞與成熟內(nèi)皮細(xì)胞之間的具有較強(qiáng)增殖分化能力、可向血管新生部位趨化并促進(jìn)血管新生的幼稚細(xì)胞[1，2]。成人EPCs存在于骨髓之中，在機(jī)體出現(xiàn)缺血、組織損傷或受到細(xì)胞因子、藥物等刺激的情況下，可從骨髓向靶部位動(dòng)員、歸巢、分化，形成新生血管，因此其在臨床各種缺血性疾病和血管損傷方面有著廣泛的應(yīng)用前景[3，4]。研究發(fā)現(xiàn)，EPCs不僅參與胚胎血管生成，還在胎兒出生后的血管新生和血管內(nèi)皮損傷修復(fù)過(guò)程中起著重要作用[5-7]。腰椎間盤(pán)退變性疾病因其高發(fā)病率和高致殘率，嚴(yán)重危害人體健康，造成了沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)。椎間盤(pán)內(nèi)無(wú)血管組織，其營(yíng)養(yǎng)來(lái)源于經(jīng)軟骨終板和纖維環(huán)的滲透作用。終板血供異?？捎绊懽甸g盤(pán)基質(zhì)代謝，促使椎間盤(pán)退變。本研究采集腰椎退變性疾病患者骨髓進(jìn)行EPCs的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定，為研究EPCs在椎間盤(pán)退變性疾病的發(fā)病機(jī)理及其預(yù)防治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll-PaquePLUS，GE Healthcare公司），小鼠抗人CD34流式抗體、E-selectin流式抗體（BD公司），CD133流式抗體（Miltenyi公司），VEGFR-2流式抗體（R&D公司），VE-Cadherin、vWF流式抗體（eBioscience公司），Dil-ac-LDL（Molecular Probes公司），F(xiàn)ITC-UEA-I（Vector公司），人纖維連接蛋白（FN，Invitrogen公司），內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基及生長(zhǎng)因子套裝（EGM-2 BulletKit）（Lonza公司）；體外血管生成試劑盒（In Vitro Angiogenesis Assay Kit，Milipore公司）；細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所）；倒置相差顯微鏡（OLYMPUS）；熒光顯微鏡（LEICA）；流式細(xì)胞儀（COULTER）。

1.2方法

1.2.1單個(gè)核細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 本研究計(jì)劃取得中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。在患者知情同意的前提下，24例成人骨髓均取自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科退變性腰椎滑脫、椎管狹窄伴腰椎不穩(wěn)、腰椎間盤(pán)突出伴退變性腰椎滑脫手術(shù)患者髂骨取骨區(qū)（2008年11月～2009年 5月，年齡38～73歲，平均61.3歲），排除血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤及乙肝表面抗原陽(yáng)性患者，2 mmol/L EDTA-PBS溶液抗凝。PBS等倍稀釋骨髓后，將骨髓按4:3比例加至于淋巴細(xì)胞分離液上，20℃2 000 r/min離心30 min。離心后，用吸管吸出中間單個(gè)核細(xì)胞層，用2倍體積PBS洗滌，1 000 r/min室溫離心7 min。以3×106/cm2接種于25 μg/ml人FN包被的培養(yǎng)瓶中。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，72 h后換液，洗去非貼壁細(xì)胞，每3天換液。倒置顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.2.2細(xì)胞增殖情況觀測(cè) 分離的原代細(xì)胞接種3d后進(jìn)行第一次換液，從第4天起，用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，將貼壁細(xì)胞重新接種于96孔板中，加入WST-8，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。每24小時(shí)檢測(cè)1次，連續(xù)10 d，觀察細(xì)胞增殖情況并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 細(xì) 胞的 染 色與 鑒 定 Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I雙熒光染色：EPCs與 10 μ g/ml Dil-ac-LDL避光孵育4 h，4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗，加入FITC-UEA-I（15μg/ml）避光孵育1 h，PBS漂洗，晾干，熒光顯微鏡下觀察。隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)非重疊視野，計(jì)算雙陽(yáng)性細(xì)胞比例。

1.2.4細(xì)胞表型檢測(cè) 流式細(xì)胞術(shù)：0.25%胰酶消化EPCs，計(jì)數(shù)，分別與CD133、CD34、VEGFR-2、VE-cadherin、E-selectin、vWF單克隆抗體在4℃孵育30 min，用PBS漂洗，300 μl PBS懸浮細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5透射電鏡分析 將EPCs輕輕刮下，2 000 r/ min室溫離心10 min，戊二醛固定30 min，離心，送透射電鏡室進(jìn)行脫水、包埋、切片、染色。

1.2.6管腔形成實(shí)驗(yàn) 將試劑盒中的膠液與緩沖液預(yù)混，鋪于板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1 h，1× 104個(gè)細(xì)胞/孔接種于體外血管生成試劑盒的ECMatrix上，培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜，12 h后倒置顯微鏡下觀察管腔形成情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1內(nèi)皮祖細(xì)胞的形態(tài)觀察和增殖情況

細(xì)胞接種時(shí)呈小圓形，24 h后可見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，并逐漸變?yōu)樗笮危毁N壁細(xì)胞仍呈圓形，體積較小；4天左右細(xì)胞明顯增殖，細(xì)胞體積增大，5天左右見(jiàn)類似血島結(jié)構(gòu)的細(xì)胞集落形成，集落邊緣細(xì)胞呈紡錘形和不規(guī)則梭形，呈放射狀單層生長(zhǎng)，集落中心細(xì)胞密集呈多層生長(zhǎng)，5～6天時(shí)梭性細(xì)胞首尾相連接形成線樣結(jié)構(gòu)，少量細(xì)胞連接，呈明顯的管壁管腔，管壁由單層細(xì)胞組成；至第7天，細(xì)胞集落逐漸增大，細(xì)胞體積變大（圖1A）；約至第10天，細(xì)胞可達(dá)到80%～90%融合，細(xì)胞集落結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞伸展呈紡錘形（圖1B）；至第14天，細(xì)胞基本鋪滿瓶底，呈鋪路石樣密集排列（圖1C）。原代細(xì)胞在接種后第3天進(jìn)行首次換液，第4～13天的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示（圖2），從細(xì)胞原代分離時(shí)算起，第4～7天為EPCs增殖潛伏期，此期細(xì)胞緩慢增殖，生長(zhǎng)曲線平緩，EPCs生長(zhǎng)至第8～11天達(dá)到增殖高峰。

2.2內(nèi)皮祖細(xì)胞的熒光雙染實(shí)驗(yàn)

采用Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I染色，于熒光顯微鏡下觀察，結(jié)合FITC-UEA-I的貼壁細(xì)胞呈綠色（圖1D），攝取Dil-ac-LDL的貼壁細(xì)胞呈紅色（圖1E），雙陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞呈黃色（圖1F），陽(yáng)性率為（95.1±4.0）%，表明其具有EPCs的特征。

2.3內(nèi)皮祖細(xì)胞的表型檢測(cè)

流式細(xì)胞儀分析培養(yǎng)7 d和14 d的細(xì)胞表達(dá)CD133、CD34、KDR、VE-Cadherin、E-selectin、vWF的陽(yáng)性率結(jié)果見(jiàn)表1及圖3，經(jīng)一定時(shí)間的誘導(dǎo)，CD133表達(dá)率下降，而相應(yīng)成熟ECs抗原KDR、E-selectin、vWF表達(dá)則增加（P＜0.05）。

圖2 EPCs生長(zhǎng)曲線

圖3 培養(yǎng)7 d、14 d的細(xì)胞流式細(xì)胞儀分析結(jié)果：細(xì)胞表達(dá)CD133、CD34、KDR、VE-Cadherin、E-selectin、vWF的陽(yáng)性率

2.4 透射電鏡分析

透射電鏡結(jié)果顯示培養(yǎng)第10天的EPCs在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含一種短棒狀小體，含平行管狀內(nèi)部結(jié)構(gòu)，即血管ECs所特有的Weibel-Palade小體（圖4）。

2.5體外血管生成實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)第8天和第15天的原代細(xì)胞消化后種植于體外血管生成試劑盒的ECMatrix上，前者12 h可見(jiàn)細(xì)胞相互連接形成管腔樣結(jié)構(gòu)（圖1G），18 h可見(jiàn)原管腔增大，旁邊有新管腔形成，而后者12 h的管腔形成能力明顯弱于前者（圖1H）。

3 討論

1997年，Asahara等[2]等首次從外周血中分離出EPCs，隨后大量研究證實(shí)，這些細(xì)胞來(lái)源于骨髓，具有旺盛的增殖能力，能夠直接分化為血管ECs，在缺血等因素的刺激下，能夠動(dòng)員人血，在受損血管的修復(fù)和缺血組織的再血管化中扮演著重要角色。

椎間盤(pán)是體內(nèi)最大的無(wú)血供組織，對(duì)退變腰椎間盤(pán)的病理學(xué)及MRI影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，腰椎間盤(pán)退變過(guò)程中軟骨終板下骨血運(yùn)改變是誘發(fā)退變的早期機(jī)制，而對(duì)退變腰椎間盤(pán)動(dòng)物模型的軟骨終板形態(tài)學(xué)研究證明，軟骨終板血供減少、鈣化導(dǎo)致的腰椎間盤(pán)營(yíng)養(yǎng)障礙，可能是啟動(dòng)腰椎間盤(pán)退變的關(guān)鍵因素[8]。體外擴(kuò)增的EPCs可整合至血管壁，促進(jìn)缺血組織的血管新生及損傷血管內(nèi)膜的再內(nèi)皮化過(guò)程[7,9]。通過(guò)移植自體EPCs或動(dòng)員骨髓中EPCs，可快速恢復(fù)血管內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)和功能[10]。骨髓來(lái)源的EPCs可能對(duì)腰椎間盤(pán)退變病人終板下骨微循環(huán)的重建具有重要作用，為椎間盤(pán)退變性疾病的防治提供了新的思路。

細(xì)胞的誘導(dǎo)分化是多種細(xì)胞、細(xì)胞因子以及微環(huán)境相互調(diào)控作用的結(jié)果，在一個(gè)更接近人體內(nèi)環(huán)境的培養(yǎng)條件下，更有利于EPCs的誘導(dǎo)分化。Murohara等[6]在體外培養(yǎng)臍血源性EPCs時(shí)發(fā)現(xiàn)，CD34－與CD34+細(xì)胞共同培養(yǎng)較CD34+細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞數(shù)量增加3倍，細(xì)胞集落數(shù)增加6倍，提示EPCs的發(fā)育可能需要CD34+細(xì)胞與CD34－細(xì)胞之間的相互作用。因此，本實(shí)驗(yàn)24例骨髓標(biāo)本均采用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞，有利于EPCs和其他細(xì)胞的相互作用，促進(jìn)EPCs生長(zhǎng)。

在本研究的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，棄去培養(yǎng)72h后的未貼壁細(xì)胞，可以避免骨髓中巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。培養(yǎng)至第7天，細(xì)胞集落逐漸增大，細(xì)胞體積變大，此時(shí)的培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)EPCs特異性抗原標(biāo)志，可特異性攝取FITC-UEA-I并內(nèi)吞Dil-ac-LDL；最后細(xì)胞分化成典型成熟ECs的鋪路石樣形態(tài)，數(shù)量也明顯增加，這說(shuō)明人骨髓單個(gè)核細(xì)胞在體外一定條件下可以分化為EPCs，且較成熟ECs有明顯的增殖優(yōu)勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞儀，分析單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化前后細(xì)胞表面表達(dá)內(nèi)皮系抗原的變化，在定向誘導(dǎo)分化早期，EPCs表面高表達(dá)CD133，隨時(shí)間推移表達(dá)比例逐漸下降，與此同時(shí)，相應(yīng)成熟的ECs抗原VE-cadherin、KDR、vWF的表達(dá)則顯著增加，表明EPCs在特定細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，逐漸失去幼稚細(xì)胞的特有標(biāo)記物CD133，開(kāi)始向成熟ECs分化。另一方面也體現(xiàn)出EPCs的不穩(wěn)定性。在老年及一些病理情況下，由于端粒酶活性降低，EPCs在體外培養(yǎng)時(shí)往往因?yàn)檠杆倮匣y以保持祖細(xì)胞性狀，表現(xiàn)為再生能力下降，倍增次數(shù)減少，凋亡加速等。

圖4 電鏡下觀察胞漿內(nèi)W-P小體(×39 000)

表1 EPCs不同時(shí)間點(diǎn)CD133、CD34、KDR、VE-Cadherin、E-selectin、vWF表達(dá)結(jié)果（±s）

表1 EPCs不同時(shí)間點(diǎn)CD133、CD34、KDR、VE-Cadherin、E-selectin、vWF表達(dá)結(jié)果（±s）

7 d 14 d t值P值CD133 18.5±4.4 3.8±4.7 3.224 0.034 CD34 45.4±7.8 36.1±2.3 1.312 0.235 KDR 66.7±7.2 81.8±6.4 2.901 0.045 VE-Cadherin 20.5±5.3 26.4±4.3 0.966 0.398 E-selectin 7.8±1.3 46.4±8.3 3.480 0.016 Vwf 5.4±1.0 38.9±6.2 5.898 0.001

實(shí)驗(yàn)中，透射電鏡觀察到培養(yǎng)10 d的細(xì)胞胞漿中已出現(xiàn)典型的Weibel-Palade小體，表明EPCs已開(kāi)始向成熟ECs分化。而通過(guò)對(duì)比不同時(shí)期EPCs的管腔形成能力，可以看出成熟ECs的成血管能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于分化早期的EPCs。

總之，我們通過(guò)系統(tǒng)的檢測(cè)，確定了采用密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)的人髂骨骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞，通過(guò)特定誘導(dǎo)條件下可分化為EPCs，EPCs純度較高。該方法穩(wěn)定性和重復(fù)性好，為研究EPCs在椎間盤(pán)退變性疾病的發(fā)病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 Isner JM,Asahara T.Angiogenesis and vasculogenesis as therapeutic strategies for postnatal neovascularization [J]. J Clin Invest,1999,103(9):1231-1236.

2 Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997, 275(5302):964-967.

3 Maeda M,Fukui A,Nakamura T,et al.Progenitor endothelial progenitor cells on vascular grafts:An ultrastructural study[J]. J Bio Mater Res,2000,51(1):55-60.

4 Gill M,Dias S,Hattori K,et al.Vascular trauma induces rapid but transient mobilization of VEGFR2+AC133+endothelial precursor cells[J].Circ Res,2001,88(2):167-174.

5 Rafii S,Oz MC,Seldomridge JA,et al.Characterization of hematopoietic cells arising on the textured surface of left ventricular assist devices[J].Ann Thorac Surg,1995,60(6): 1627-1632.

6 Murohara T,Ikeda H,Duan J,et al.Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization[J].J Clin Invest,2000,105(11):1527-1536.

7 Kawamoto A,Tkebuchava T,Yamaguchi JI,et al.Intramyocardial transplantation of autologous endothelial progenitor cells for therapeautic neovascularization of myocardial ischemia[J]. Circulation,2003,107(3):461-468.

8 Jünger S,Gantenbein-Ritter B,Lezuo P,et al.Effect of limited nutrition on in situ intervertebral disc cells under simulatedphysiological loading.Spine,2009,34(12):1264-1271.

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10 Rafii S,Meeus S,Dias S,et al.Contribution of marrowderived progenitors to vascular and cardiac regeneration[J]. Semin Cell Dev Biol,2002,13(1):61-67.

（本文編輯 白朝暉）

Cultivation and identification of endothelial progenitor cells from human bone marrow

TANG Yu-bo*,CHEN Xiao,HUANG Bao-ding,FENG Xin,PENG Long-yun,PENG Xin-sheng,ZOU Xue-nong.*Department of Pharmacy,the First Hospital Affiliated of SUN Yat-sen University,Guangzhou,Guangdong 510080,China Corresponding author:ZOU Xue-nong,E-mail：zxnong@hotmail.com

Objective To establish methods of isolation,cultivation,induction and identification for endothelial progenitor cells(EPCs)from human bone marrow in vitro.Methods Mononuclear cells were collected by density gradient centrifugation from the bone marrow of 24 patients with intervertebral disc degeneration.The isolated cells were cultivated in dishes coated with fibronectin and induced by angiogenic growth factors. Immuno-fluorescence staining and flow cytometry were used to indentify EPCs.The differentiation of EPCs to endothelial cells(ECs)was determined by transmission electron microscope(TEM)and in vitro angiogenesis. Results Cell colony-forming units appeared 72 hours after seeding and increased obviously after 5 days.One week later the cells confluenced to 80%.Attached cells formed cobblestone like structure by 14 days.The uptake rate of Dil-ac-LDL and FITC-UEA-I was（95.1±4.0）%.Flow cytometric analysis showed that positive rate of CD133,CD34,KDR,and VE-Cadherin was（18.5±4.4）%,（45.4±7.8）%,（66.7±7.2）%,and（20.5±5.3）%, respectively.Weibel-Palade body was observed in endochylema under TEM.The cells cultivated for 7 days to 12 days formed tube-like structure on ECMatrix.Conclusions EPCs could be efficiently isolated by density gradient centrifugation combined with induction by EGM-2 medium from human bone marrow.EPCs had angiogenic potential between 7 days to 12 days.

Endothelial cells;Bone marrow cells;Cells,cultured;Cell separation

R329.2

A

1674-666X(2009)01-0056-06

“中-德生物技術(shù)青年科學(xué)家小組”計(jì)劃（國(guó)科生便子［2009］004號(hào)）；NSFC-廣東聯(lián)合基金（u0732001）

510080廣州，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部（唐欲博、李孝），脊柱外科（黃保丁、彭新生、鄒學(xué)農(nóng)），心血管內(nèi)科（彭龍?jiān)疲?；中山大學(xué)藥學(xué)院（馮鑫）

鄒學(xué)農(nóng)，E-mail：zxnong@hotmail.com