分子標記技術在蓮遺傳多樣性分析中的應用

王蕓 劉玉平 劉義滿 柯衛(wèi)東

（武漢市蔬菜科學研究所，湖北武漢，430065）

分子標記技術在蓮遺傳多樣性分析中的應用

王蕓 劉玉平 劉義滿 柯衛(wèi)東

（武漢市蔬菜科學研究所，湖北武漢，430065）

分子標記是繼形態(tài)標記、細胞標記、生化標記之后出現的一種全新的遺傳標記方法，已被廣泛地應用于生命科學研究的各個領域。主要介紹了現階段常用的幾種分子標記技術，以及這些標記技術在蓮遺傳多樣性分析中的應用，并對其應用前景進行了展望。

分子標記 蓮 遺傳多樣性

分子標記是繼形態(tài)標記、細胞標記、生化標記之后出現的一種全新的遺傳標記方法，是DNA分子水平上遺傳多態(tài)性的直接反映。DNA水平的遺傳多態(tài)性表現為核苷酸序列的任何差異，哪怕是單個核苷酸的變異。因此，DNA標記在數量上幾乎是無限的。相比以往的遺傳標記，分子標記技術具有很多特殊的優(yōu)點，例如無表型效應、不受環(huán)境限制與影響等等。由于分子標記直接利用DNA分子中可讀的核苷酸序列變異信息，為遺傳育種提供了大量的基因組信息，所以現階段分子標記技術已廣泛地應用于種質資源研究、遺傳圖譜構建、目的基因定位和克隆以及分子標記輔助選擇育種等各個方面。

近年來，在國內，有用RAPD，AFLP，ISSR等分子標記對中國蓮藕的研究報道[1～3]。

1 分子標記在蓮遺傳多樣性分析中的應用

1.1 親緣關系分析

目前，有研究表明分子標記技術更能直接從分子水平上揭示蓮藕不同品種之間的差異和相關性。彭欲率等[4]利用AFLP對12個蓮藕品種進行了多態(tài)性分析，并用UPMGA方法進行聚類分析從而顯示這12個蓮藕品種之間的親緣關系，聚類分析的結果與品種的譜系關系是相當吻合的。韓延闖等[5]采用RAPD技術對14個蓮藕品種進行遺傳多態(tài)性分析，用5個Operon引物和80個SBS的RAPD引物進行篩選，從中選出來自SBS的RAPD-C13和RAPD-D15擴增出的8條多態(tài)性條帶，繪制了14個品種的DNA指紋圖譜，在該圖譜中每個品種均有各自特異的DNA指紋。郭宏波等[6]利用17個隨機引物對32份蓮屬（Nelumbo）品種資源進行RAPD分析。擴增形成207條譜帶，其中多態(tài)性條帶193條，占93.23%，顯示該屬植物在我國具有豐富的遺傳多樣性。分析結果還表明蓮屬種質資源可分為3個品種群：花蓮、籽蓮和藕蓮，這與傳統(tǒng)的園藝學分類相一致；美洲黃蓮與中國蓮的花蓮之間在DNA水平上差異不大，遺傳背景與花蓮更相似；藕蓮、籽蓮和花蓮可能由不同遺傳背景的野蓮演化而來。薛建華等[7]對黑龍江流域、松花江流域和烏蘇里江流域采集的49份野生蓮和全國各地的27份栽培蓮進行ISSR和RAPD分析發(fā)現，野生蓮的遺傳多樣性低于栽培蓮。潘磊等[8]采用FIASCO（Fast Isolation by AFLP of Sequence Containing Repeats）微衛(wèi)星分子標記，利用磁珠表面的鏈親和素與生物素標記的SSR探針之間的結合，從而達到富集SSR的目的。該研究采用磁珠富集法分離篩選蓮藕的微衛(wèi)星分子標記，同時，篩選獲得的SSR分子標記可以為蓮藕種質資源親緣關系的鑒定、遺傳多樣性的檢測和遺傳圖譜的構建等打下基礎。

總之，分子標記技術的利用，使從DNA分子水平上研究蓮遺傳多樣性成為可能，分子標記在分析蓮不同品種的系譜關系、親緣品種群間的系統(tǒng)發(fā)生關系及分類地位等方面都起著重要的作用[9]。

1.2 品種鑒定

蓮藕是通過無性繁殖繁衍后代的水生蔬菜，其個體差異并不是那么明顯，人們僅僅依靠傳統(tǒng)的形態(tài)特征觀察難以識別，而通過分子標記手段來鑒定則更加準確?？椎抡萚10]利用RAPD標記技術，對8個碗蓮品種進行了遺傳多態(tài)性分析，從70個10堿基隨機引物中，篩選出多態(tài)性頻率較高的引物4個，擴增后共得到14條多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性為70%。選擇6條清晰度高的多態(tài)性條帶繪制8個碗蓮品種的指紋圖譜，在該圖譜中每個品種均有各自特異的DNA指紋。該項研究結果為碗蓮品種的鑒定和保護提供了一種有效的方法。全志武等[11]在開發(fā)出蓮基因組SSR引物對的基礎上，采用SSR分子標記技術嘗試鑒別10個藕蓮推廣品種。篩選出16對SSR有效引物進行PCR擴增，其中6對引物CL1，CL2，CL4，CL9，CL14，CL16共擴增出15條多態(tài)性條帶，對所得到的10個藕蓮品種的SSR指紋圖譜進行組合和綜合分析，可以將供試的10個品種區(qū)分開來，該項研究表明利用SSR技術進行藕蓮品種鑒定是可行而有效的。

1.3 蓮遺傳育種研究

現階段雜交育種仍是蓮遺傳育種的主要技術之一，而雜交親本的選配是雜交育種的關鍵步驟。親本的選配必須考慮的一個重要因素是測定親本的遺傳距離，確定其親緣關系。傳統(tǒng)育種方法主要是利用表型特性來確定其親緣關系，由于蓮藕的一些重要農藝性狀遺傳能力往往較弱，或者極易受到壞境等因素的影響，這種方法難免效率偏低。分子標記由于受環(huán)境因素影響小，且數量多，因而可以快速鑒別親本之間的親緣關系，從而使人們在育種篩選過程中節(jié)省大量的人力物力和時間。

瞿楨等[12]利用分子標記SRAP（相關系列擴增多態(tài)性，sequence-related amplified polymorphism）技術對國內廣泛栽培以及新近育成的39個蓮品種進行了DNA多態(tài)性分析。選取5對引物擴增基因組DNA，共獲得101條條帶，其中88條為多態(tài)性條帶，每對引物平均提供20個標記信息。由UPMGA方法得到的聚類分析結果表明了39個品種間的遺傳關系，結果表明，花蓮、籽蓮和藕蓮三大類群有明顯的界限，花蓮和籽蓮的遺傳距離較近，藕蓮與它們的遺傳距離較遠。分子方差分析結果表明，蓮品種間和品種內均存在遺傳變異，藕蓮品種內的遺傳變異略低于品種間的遺傳變異，而誘變籽蓮、誘變花蓮和常規(guī)籽蓮品種內遺傳變異均大于品種間的遺傳變異，尤其是誘變籽蓮、誘變花蓮品種內遺傳變異占總變異的分量分別超過了70%和60%，這種品種內的遺傳變異，一方面對于蓮的高產穩(wěn)產具有重要的意義，另一方面也說明了從這些國內廣泛栽培的品種以及新近育成的蓮品種中可以直接進一步選育出更優(yōu)良的新品種。

2 展望

分子標記技術作為常規(guī)育種有力的輔助工具，已經受到國內外作物育種界的普遍重視。分子標記為蓮遺傳多樣性研究開辟了新的途徑。它在基因組圖譜構建、基因定位、品種鑒定、種質資源評價及雜交育種等方面已顯示出非常誘人的前景。但要將分子標記廣泛而深入地應用到遺傳育種的各個領域，還應注意以下幾個方面：第一，尋找新型的分子標記方法；第二，簡化分子標記技術，降低實驗成本，實現檢測過程的自動化；第三，改進分析基因組的方法和技術。另外，由于標記鑒定與輔助育種還有很大的脫節(jié)，因此還需要進一步的完善。我們相信隨著分子標記技術的日臻完善，它必將在植物育種中發(fā)揮越來越重要的作用。

[1]汪嵐，韓延闖，彭欲率，等.ISSR標記技術在蓮藕遺傳研究中的運用[J].氨基酸和生物資源，2004，26（3）：20-22.

[2]Xue J H,Zhuo L H,Zhou S L.Genetic diversity and geographic pattern of wild lotus (Nelumbo nucifera)in Heilongjiang Province[J].Chinese Science Bulletin，2006，51 (4)：421-432.

[3]Han Y C,Teng C Z,Zhong S,et al.Genetic variation and clonal diversity in populations of Nelumbo nucifera(Nelumbonaceae)in central China detected by ISSR markers[J]. Aquatic Botany，2007，86：69-75.

[4]彭欲率，韓延闖，汪嵐，等.應用AFLP技術檢測蓮藕遺傳多樣性的初步研究[J].分子植物育種，2004，2（6）：823-827.

[5]韓延闖，刁英，周立，等.蓮藕品種DNA指紋圖譜的繪制[J].武漢植物學研究，2004，22（3）：193-196.

[6]郭宏波，柯衛(wèi)東，李雙梅，等.不同類型蓮資源的RAPD聚類分析[J].植物遺傳資源學報，2004，5（4）：328-332.

[7]薛建華，卓麗環(huán)，周世良.黑龍江省野生蓮的遺傳多樣性及其地理式樣[J].科學通報，2005，51（3）：61-70.

[8]潘磊，鄭鵬，徐杰，等.磁珠富集法制備蓮藕基因組的微衛(wèi)星分子標記[J].中國蔬菜，2007（增刊）：7-13.

[9]周奕華，陳正華.分子標記在植物學中的應用及前景[J].武漢市植物學研究，1999，17（1）：75-86.

[10]孔德政，劉藝平，楊秋生.8個碗蓮品種的DNA指紋鑒定[J].南京農業(yè)大學學報，2009，32（2）：147-150.

[11]全志武，汪靜，潘磊，等.10個蓮藕品種SSR指紋圖譜的構建與品種鑒定[J].中國蔬菜，2008（3）：15-17.

[12]瞿楨，魏英輝，李大威，等.蓮品種資源的SRAP遺傳多樣性分析[J].氨基酸和生物資源，2008，30（3）：21-25.

Application of Molecular Markers in Genetic Diversity of Lotus(Nelumbo)

WANG Yun,LIU Yuping,LIU Yiman,KE Weidong

Molecular markers are one kind of new genetic markers following the morphological markers,cytological markers and biochemical markers.Therefore they have been extensively applied in each areas of life science.Some commonly used methods of molecular markers and their application in genetic diversity of lotus was introduced.And the prospect of their application was also discussed.

Molecular markers;Lotus;Genetic diversity.

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.16.003 Gaertn.）

王蕓，女，博士，主要從事水生蔬菜遺傳多樣性研究，電話：027-88116313。E-mail:wdland1981@163.com

2009-07-22