蕓薹屬作物游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展

劉樂承，付明星，林小芳

(長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州，434025)

蕓薹屬作物游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展

劉樂承，付明星，林小芳

(長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州，434025)

綜述了蕓薹屬(Brassica)作物游離小孢子培養(yǎng)的研究進(jìn)展，主要涉及到影響培養(yǎng)的主要因素和培養(yǎng)技術(shù)在育種中的應(yīng)用2個(gè)方面。

蕓薹屬(Brassica)；游離小孢子培養(yǎng)；育種

蕓薹屬(Brassica)是十字花科植物300多個(gè)屬中最重要的一個(gè)屬，主要包括白菜類、甘藍(lán)類和芥菜類3大類蔬菜，種質(zhì)資源非常豐富，是我國(guó)栽培面積最大的蔬菜作物[1]。近年來(lái)，隨著我國(guó)蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，蕓薹屬作物育種面臨許多新的問(wèn)題和挑戰(zhàn)。小孢子是高等植物生活史中雄配子體發(fā)育過(guò)程中短暫而重要的階段。游離小孢子培養(yǎng)(Isolated microspore culture)是指不經(jīng)任何形式的花藥預(yù)培養(yǎng)，直接從花蕾或花藥中獲取游離狀態(tài)的新鮮小孢子群體進(jìn)行培養(yǎng)的方法。蕓薹屬作物游離小孢子培養(yǎng)始于1982年，Lichter[2]首次對(duì)甘藍(lán)型油菜(B.napus)游離小孢子培養(yǎng)并形成植株做了報(bào)道。此后，游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)先后在蕓薹屬作物中的結(jié)球甘藍(lán)、大白菜、花椰菜、小白菜、黑芥、葉芥、青花菜等十余種蔬菜中取得了一定進(jìn)展[3～5]。該技術(shù)具有基因型純合速度快、分離較簡(jiǎn)單、基因型固定、可作為外源基因的良好受體等優(yōu)點(diǎn)。因此，游離小孢子培養(yǎng)研究對(duì)蕓薹屬作物的基礎(chǔ)研究與應(yīng)用研究均具有十分重要的意義。

1 游離小孢子培養(yǎng)的影響因素研究

1.1 外植體對(duì)小孢子胚狀體發(fā)生的影響

(1)基因型的影響 Vyvadilova等[6]對(duì)幾種甘藍(lán)類蔬菜的研究發(fā)現(xiàn)，基因型和小孢子發(fā)育階段是影響小孢子出胚率的主要因素。劉凡等[7]則發(fā)現(xiàn)結(jié)球白菜比不結(jié)球白菜、結(jié)球白菜中的疊抱類型比合抱類型、早熟類型比晚熟類型具有更強(qiáng)的胚胎發(fā)生能力。嚴(yán)準(zhǔn)等[8]在同樣條件下對(duì)4種甘藍(lán)材料進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，只有苤藍(lán)有胚狀體產(chǎn)生，青花菜僅誘導(dǎo)出了大量愈傷組織，青苤藍(lán)和結(jié)球甘藍(lán)既無(wú)胚狀體又無(wú)愈傷組織產(chǎn)生。王濤濤[1]也只在73.3%的大白菜、76.9%的紫菜薹和50%的甘藍(lán)中分別獲得了小孢子胚狀體。而桑玉芳[9]的研究結(jié)果表明19個(gè)甘藍(lán)基因型小孢子培養(yǎng)的誘導(dǎo)率差異顯著，其中3個(gè)無(wú)法獲得胚狀體。因此，胚狀體的誘導(dǎo)與供體材料的基因型密切相關(guān)。此外，供體材料的不同基因型之間產(chǎn)胚率也存在較大差異，如曹鳴慶等[10]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)胚率最高的大白菜的平均產(chǎn)胚率可達(dá)350個(gè)/蕾，而大多數(shù)基因型的大白菜平均產(chǎn)胚率在2個(gè)/蕾以下。

(2)植株生理狀態(tài)的影響 Duijs等[11]對(duì)供體植株的生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)小胞子培養(yǎng)的影響進(jìn)行了研究，認(rèn)為高大健壯的植株出胚率較高、出胚比較穩(wěn)定。另外，小孢子培養(yǎng)還受供體植株生長(zhǎng)環(huán)境，如溫度、光照等的影響。方淑桂等[12]認(rèn)為大白菜供體植株生長(zhǎng)在10～25 ℃氣溫條件下較適宜，最高氣溫超過(guò)28 ℃時(shí)小孢子胚狀體誘導(dǎo)率大大降低。官春云[13]在油菜小孢子培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，來(lái)自生長(zhǎng)室的供體植株，小孢子成胚的百分率高。

為了獲得活力較高的小抱子，供體植株的栽培季節(jié)也很重要。曹鳴慶等[10]認(rèn)為大白菜的開花季節(jié)為4～5月，此時(shí)溫度一般較高，為了提高小孢子胚胎發(fā)生率應(yīng)把供體植株花期安排在冬季和早春。花椰菜的花藥培養(yǎng)也是冬、春季效果好于夏、秋季[14]。為供體植株創(chuàng)造適宜的生長(zhǎng)條件，使其不受逆境影響，是提高小孢子培養(yǎng)出胚率的重要保證。

(3)小孢子發(fā)育階段的影響 小孢子發(fā)育階段分為單核期、雙核期和三核期，單核期又可分為單核早期、單核中期和單核靠邊期。胚胎發(fā)生的激發(fā)啟動(dòng)大致發(fā)生在單核中期至單核靠邊這一短暫的發(fā)育過(guò)程中。小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾形態(tài)指標(biāo)，如花蕾長(zhǎng)度、花藥長(zhǎng)度、花瓣長(zhǎng)/花藥長(zhǎng)等密切相關(guān)。曹鳴慶等[10]發(fā)現(xiàn)，CC11基因型大白菜花蕾長(zhǎng)2.0～2.5 mm時(shí)，小孢子處于單核中期至單核靠邊期，小孢子胚產(chǎn)量最高。李巖等[15]也報(bào)道小白菜單核中期至單核靠邊期的小孢子易于誘導(dǎo)胚胎發(fā)生。張德雙等[16]、桑玉芳[9]分別發(fā)現(xiàn)綠花菜、甘藍(lán)的小孢子胚誘導(dǎo)率以單核靠邊期到雙核早期階段最高。王濤濤[1]發(fā)現(xiàn)在添加一定量的活性炭時(shí)和設(shè)定一定花粉密度時(shí)，選擇單核靠邊期比率為50～70%的小孢子，有利于大白菜和紫菜薹的小孢子發(fā)生，而在選擇含10～30%的雙核期小孢子有利于甘藍(lán)的小孢子發(fā)生。因此，在培養(yǎng)中要根據(jù)不同品種依據(jù)不同的形態(tài)指標(biāo)來(lái)獲取最適宜誘導(dǎo)的小孢子群體。

1.2 培養(yǎng)方法和條件的影響

(1)花粉預(yù)處理的影響 對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行預(yù)處理，通過(guò)外界的脅迫作用使小孢子發(fā)生一系列的生理生化變化，促使小孢子完成脫分化啟動(dòng)，從而改變小孢子的發(fā)育途徑，提高培養(yǎng)效率。預(yù)處理操作包括離心、低溫、高溫、射線、甘露醇預(yù)處理和預(yù)培養(yǎng)等方式，目的在于改變細(xì)胞的生理狀態(tài)、分裂方式和發(fā)育途徑。自從Keller和Armstrong[17]在甘藍(lán)型油菜花粉培養(yǎng)中，首次用高溫處理提高花粉胚的誘導(dǎo)頻率獲得成功以后，該方法被廣泛用于蕓薹屬植物的游離小孢子培養(yǎng)[1]。甘藍(lán)小孢子在30～35 ℃下預(yù)處理24～48 h，可以明顯提高胚狀體誘導(dǎo)效率。周偉軍等[18]對(duì)油菜游離小孢子分別進(jìn)行32 ℃和30 ℃熱激暗培養(yǎng)3 d和7 d，胚胎發(fā)生好、產(chǎn)胚率高。但是，桑玉芳[9]在甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)前對(duì)花蕾進(jìn)行0～4 ℃ 48 h的低溫預(yù)處理，在培養(yǎng)初期給予小孢子33 ℃ 24 h的高溫暗培養(yǎng)，可以獲得較好的誘導(dǎo)效果。張小玲等[19]以強(qiáng)度300 mT的均勻磁場(chǎng)處理花椰菜花藥30 min，取得了較好效果。在游離小孢子培養(yǎng)中前期的預(yù)處理是非常必要的，它不僅提高了小孢子胚產(chǎn)率，也會(huì)影響小孢子再生植株的二倍體株率。

(2) 培養(yǎng)基及附加物質(zhì)的影響 培養(yǎng)基是誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的基礎(chǔ)，用于小孢子培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分因植物材料的不同而差異較大，但其組成應(yīng)盡可能確保維持小抱子活力，提供小孢子胚胎發(fā)生所必需的有機(jī)、無(wú)機(jī)成分，以達(dá)到高的胚誘導(dǎo)頻率。一般在小孢子胚狀體的誘導(dǎo)培養(yǎng)中，所采用的基本培養(yǎng)基為NLN培養(yǎng)基。與MS、B5等培養(yǎng)基相比，NLN的主要特點(diǎn)是大量元素含量較低。余鳳群和劉后利[20]比較發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜小孢子在MS、B5培養(yǎng)基上未發(fā)現(xiàn)胚狀體，在1/2 MS、1/2 B5培養(yǎng)基上形成少量胚狀體，在NLN上形成大量胚狀體。

培養(yǎng)基的外源激素是小孢子培養(yǎng)中必不可少的成分，但關(guān)于外源激素對(duì)小孢子胚胎發(fā)生和植株再生的影響還未取得一致的認(rèn)識(shí)。如2001年許艷輝等[21]報(bào)道，0.2 mg/L的6-BA對(duì)大白菜小孢子胚胎發(fā)生有一定的促進(jìn)作用，而桑玉芳[9]發(fā)現(xiàn)激素在甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)中具有重要的影響，但是不同的基因型對(duì)激素的反應(yīng)不同。

大量試驗(yàn)研究表明培養(yǎng)基中添加適量活性炭(AC,Activated charcoal)能明顯促進(jìn)小孢子的胚胎發(fā)生。楊清等[22]在冬花椰菜小孢子培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中加入0.5 g/L的AC能提高發(fā)生率。Halkjaer等[23]認(rèn)為pH在6.0附加AC可促進(jìn)胚產(chǎn)量。王濤濤[1]發(fā)現(xiàn)在添加一定量的AC時(shí)有利于大白菜、紫菜薹和甘藍(lán)的小孢子發(fā)生。桑玉芳[9]也發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加AC，甘藍(lán)基因型胚產(chǎn)量所占比例在總體上有大幅度的提高。在培養(yǎng)初期，培養(yǎng)基中添加秋水仙素可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，有助于小孢子發(fā)育成胚， 如顧宏輝等[24]用0.8 mg/L秋水仙堿直接處理分離小孢子液也能明顯增加胚狀體產(chǎn)量。

(3)花粉密度的影響 不同密度的小孢子對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)的競(jìng)爭(zhēng)，以及自身在發(fā)育過(guò)程中不同物質(zhì)的代謝都對(duì)小孢子的發(fā)育有很大的影響。李巖等[15]發(fā)現(xiàn)大白菜小孢子培養(yǎng)時(shí)采用1×105個(gè)/mL的密度比較適宜；Dias等[25]研究表明甘藍(lán)類小孢子密度以2×104～4×104個(gè)/mL最適；而王濤濤[1]發(fā)現(xiàn)在一定的小孢子發(fā)育階段和添加適量的活性炭時(shí)，將密度設(shè)為1.5～2個(gè)花蕾/mL，有利于大白菜和紫菜薹的小孢子發(fā)生，而將密度設(shè)為1.5個(gè)花蕾/mL有利于甘藍(lán)的小孢子發(fā)生。

2 游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種中的應(yīng)用研究

2.1 雙單倍體育種

在育種中，由小孢子產(chǎn)生的雙單倍體(DH,Double haploid)后代是純系群體，可直接應(yīng)用于蕓薹屬作物育種。隱形基因在DH群體中出現(xiàn)的頻率(1/2n)是常規(guī)育種中F2群體(1/22n)的2n倍(n為基因?qū)?shù))，能有效提高隱性基因的選擇效率。DH系還具有同單粒后代相似的農(nóng)藝形狀和綜合特性。Plamer等[26]對(duì)綠花菜的DH群體及其雜交種的觀察和研究表明，大多數(shù)DH系雖然形態(tài)、產(chǎn)量不及親本，但DH雜交種各項(xiàng)性狀明顯好于親本和DH系。

蕓薹屬作物雙單倍體品種已陸續(xù)育成。耿建峰等[27]利用小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生的兩個(gè)自交不親和系配制出具有早熟耐熱、品種好、抗病性強(qiáng)等優(yōu)良性狀的花椰菜DH雜交種‘豫雪60’；隨后他們還選育出早熟高產(chǎn)、抗先期抽薹的春甘藍(lán)DH雜交新品種‘豫生1號(hào)’。吳江生等[28]成功育成了我國(guó)第一個(gè)雙低DH甘藍(lán)型油菜品種‘華雙3號(hào)’。

此外，小孢子培養(yǎng)技術(shù)也應(yīng)用于常規(guī)雜交育種和遠(yuǎn)緣雜交育種中。石淑穩(wěn)等[29]分別從甘藍(lán)型油菜與諸葛菜(Orychophragmusvlolaceus)的屬間雜種進(jìn)行小孢子培養(yǎng)獲得小孢子再生植株，周永明等[30]在甘藍(lán)型油菜與白菜型油菜、甘藍(lán)型油菜與芥菜型油菜的種間雜交中獲得了小孢子胚和再生植株，為蕓薹屬植物遠(yuǎn)緣雜交和種間育種創(chuàng)造種質(zhì)資源開辟了新途徑。

2.2 突變育種

小孢子具有單倍體和單細(xì)胞特性，且群體大，是理想的突變材料。目前應(yīng)用于蕓薹屬作物小孢子培養(yǎng)突變體的方法有2類，一類是化學(xué)方法，如疊氮化鈉(NaN3)、亞硝基尿烷(ENU)和甲基磺酸乙酯(EMS)，另一類是物理方法，如χ射線、γ射線和UV紫外線。UV是被最廣泛應(yīng)用的突變劑。Ahmad等[31]通過(guò)UV處理甘藍(lán)型油菜小孢子，表明小孢子對(duì)UV極為敏感，并篩選出對(duì)油菜黑斑病抗性強(qiáng)的再生植株。曹鳴慶等[10]將大白菜黑斑病毒素加入培養(yǎng)基，誘導(dǎo)得到的小孢子胚中篩選出了對(duì)黑斑病表現(xiàn)一定抗性的大白菜小孢子植株。Barro等[32]用EMS誘變埃塞俄比亞油菜(B.carinata)小孢子，再生植株的種子芥酸含量差異很大。

2.3 基因工程育種

外源基因?qū)胗坞x小孢子并加倍后，可以最大限度的降低轉(zhuǎn)基因植株的嵌合性和雜合性，通過(guò)小孢子胚能快速、有效地篩選出含有轉(zhuǎn)基因的胚狀體，較大地提高基因的轉(zhuǎn)化效率[33～36]。Dormann等[37]建立了白菜型和甘藍(lán)型油菜分離小孢子根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和無(wú)損篩選系統(tǒng)。陳軍等[36]以甘藍(lán)型油菜小孢子為受體，利用激光束穿刺法導(dǎo)入蕪菁花葉病毒外殼蛋白基因，最終獲得1株轉(zhuǎn)化植株。劉凡等[38]利用大白菜小孢子胚狀體獲得抗草胺膦除草劑轉(zhuǎn)基因植株。隨著游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的日益成熟，必將推動(dòng)基因工程的發(fā)展。

3 問(wèn)題與展望

游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展十分迅速，但在理論和應(yīng)用上仍存在許多問(wèn)題。其核心問(wèn)題是小孢子脫分化的啟動(dòng)和胚胎的發(fā)育未能完全明了；離體條件下小孢子的發(fā)育不同步和多種發(fā)育途徑并存，使人們難以用先進(jìn)的現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)去深入研究小孢子的某些生化過(guò)程；雖然蕓薹屬植物的小孢子培養(yǎng)再生植株普遍具有一定的自然加倍率，這對(duì)植物的育種工作非常有利，但小孢子植株的加倍機(jī)理仍不明確。此外，現(xiàn)有的研究多局限于培育技術(shù)方法方面，在育種中的應(yīng)用也較少，而蕓薹屬作物的生育期以及誘導(dǎo)率不高也限制了該項(xiàng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用。今后應(yīng)加強(qiáng)理論和技術(shù)研究，深入探討小孢子發(fā)育的調(diào)控機(jī)理，建立程序化的培作，為作物育種改良提供快捷有效的手段。

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2009-07-18

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2007ABA386)；湖北省荊州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20081P033)

劉樂承(1964-)，男，湖北洪湖人，農(nóng)學(xué)博士，教授，主要從事園藝植物育種的教學(xué)與研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.03.018

Q813.1

A

1673-1409(2009)03-S056-04