趨化因子配體16對人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1生物學(xué)行為的影響

杜杰 江濤 王西墨 張姝翌

·論著·

趨化因子配體16對人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1生物學(xué)行為的影響

杜杰 江濤 王西墨 張姝翌

目的探討趨化因子配體16(CXCL16)對人胰腺癌細(xì)胞PANC1生物學(xué)行為的影響。方法取對數(shù)生長期的人胰腺癌細(xì)胞PANC1，分別加入50、100、200 ng/ml的重組人CXCL16(rhCXCL16)和抗CXCL16抗體處理4 h，以不加rhCLCL16作為對照。采用MTT法檢測細(xì)胞增殖，采用Mqrtigel基質(zhì)檢測細(xì)胞的黏附率，采用Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力。結(jié)果100 ng/ml rhCXCL16處理PANC1細(xì)胞后，細(xì)胞增殖、對基質(zhì)的黏附率、侵襲和遷移能力分別為0.264±0.021、(91.4±8.6)%、1.246±0.216、1.361±0.276，其中細(xì)胞對基質(zhì)的黏附率、侵襲和遷移能力均顯著高于對照組的(20.6±3.2)%、0.259±0.013、0.199±0.008(Plt;0.01)，對細(xì)胞的增殖不影響；200 ng/ml rhCXCL16處理后，細(xì)胞對基質(zhì)的黏附率、侵襲和遷移能力進(jìn)一步提高到(92.1±6.3)%、1.511±0.174、1.600±0.208(Plt;0.05)。結(jié)論CXCL16可誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞PANC1增強(qiáng)對基質(zhì)的黏附性、侵襲性和遷移性。

胰腺腫瘤； 趨化因子類； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞黏附； 細(xì)胞侵襲； 細(xì)胞遷移

中國已成為腫瘤致死原因的第4位[1]。胰腺癌治療效果不佳的主要原因之一是癌細(xì)胞高度惡性的生物學(xué)行為，因此對其生物學(xué)行為影響因素的深入了解有利于胰腺癌的綜合治療。CXCL16是2000年底新發(fā)現(xiàn)的腫瘤微環(huán)境中重要的趨化因子類炎性介質(zhì)。本實驗觀察不同濃度的CXCL16對人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1生物學(xué)行為的影響。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1購自南京凱基生物技術(shù)公司，在37℃、90%濕度、5% CO2條件下，置10% FBS DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)傳代。收集細(xì)胞，調(diào)整濃度為105/ml。將100 μl PANC1細(xì)胞接種于24孔板中，每孔加入100 μl重組人CXCL16(rhCXCL16)，濃度分別為50、100、200 ng/ml以及200 ng/ml+CXCL16中和性抗體1 μg/ml，以不加rhCXCL16作為對照組。每種濃度設(shè)5個復(fù)孔。

二、細(xì)胞增殖檢測

采用MTT法。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后每孔加入MTT 20 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，震蕩10 min，取100 μl加入96孔板，用酶標(biāo)儀測各孔A490值。

三、細(xì)胞黏附率檢測

采用Martigel基質(zhì)黏附法。以每孔50 μl Martigel包被基底膜，加入上述各組細(xì)胞37℃孵育4 h，PBS清洗未黏附的細(xì)胞2次，加入無血清DMEM 100 μl及MTT 20 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h;棄上清，加入150 μl DMSO，輕輕振蕩10 min，上酶標(biāo)儀測各孔A490值。以37℃孵育4 h后，每孔直接添加20 μl MTT溶液的各組細(xì)胞作為對照。細(xì)胞黏附率=(實驗組A490值/對照組A490值)%。

四、細(xì)胞侵襲力檢測

采用Transwell小室檢測[2]。Transwell細(xì)胞侵襲小室購自美國Corning公司。用預(yù)冷無血清培養(yǎng)基1∶5稀釋Matrigel膠后包被基底膜，下室加入5%FBS培養(yǎng)基0.8 ml ，再依次加入不同濃度的rhCXCL16各100 μl，上室加入0.2 ml濃度為5×105/m1的細(xì)胞懸液，每組5個復(fù)孔。CO2培養(yǎng)箱孵育48 h后，采用MTT法測下室細(xì)胞A490值。

五、細(xì)胞遷移能力檢測

除Transwell上室中不加入Matrigel外，其余操作同細(xì)胞體外侵襲實驗，以下室細(xì)胞的A490值表示腫瘤細(xì)胞的遷移能力。

六、統(tǒng)計分析

結(jié) 果

一、細(xì)胞增殖的變化

對照組、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml rbCXCL16和200 ng/ml rbCXLL16+CXCL16抗體組細(xì)胞的A490值分別為0.231±0.020、0.252±0.011、0.264±0.021、0.286±0.011和0.242±0.010，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)。

二、細(xì)胞黏附率的變化

對照組、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml rbCXCL16和200 ng/ml rbCXCL16+CXCL16抗體組細(xì)胞的黏附率分別為(20.6±3.2)%、(67.9±5.7)%、(91.4±8.6)%、(92.1±6.3)%和(25.1±3.7)%。隨著rhCXCL16濃度的增加，PANC1細(xì)胞的黏附率顯著性增高(Plt;0.01)，但加抗體組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

三、細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化

對照組、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml rbCXCL16和200 ng/ml rbCXCL16+CXCL16抗體組的細(xì)胞侵襲能力分別為0.259±0.013、0.347±0.091、1.246±0.216、1.511±0.174和0.261±0.038；遷移能力分別為0.199±0.008、0.408±0.103、1.361±0.276、1.600±0.208和0.312±0.066。隨著CXCL16濃度的增加，PANC1細(xì)胞的侵襲和遷移能力均增高，其中100、200 ng/ml組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.01)，其余各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)。

討 論

近年來，腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的惡性度研究已成為熱點。國外實驗研究表明，CXCL16在前列腺癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌組織中顯著性高表達(dá)，且rhCXCL16能誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3、LNCaP細(xì)胞的侵襲和遷移能力[3-5]。本實驗結(jié)果顯示，隨著rhCXCL16濃度的增加，各組細(xì)胞的增殖能力無顯著差異，說明rhCXCL16對胰腺癌細(xì)胞生長的影響不大，這與Wente等[6]報道的rhCXCL16對胰腺癌細(xì)胞株BxPC3、CAPAN-1細(xì)胞增殖能力無明顯影響相一致。分析原因可能是rhCXCL16并不是通過提高癌細(xì)胞數(shù)量來增強(qiáng)其轉(zhuǎn)移能力。但隨著rhCXCL16濃度的增加，各組細(xì)胞對基質(zhì)的黏附率、侵襲和遷移能力均呈劑量依賴性增加，提示其通過影響細(xì)胞上述三種生物學(xué)行為來促進(jìn)癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。細(xì)胞對基質(zhì)黏附率的增加可能是rhCXCL16使由黏附分子介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞彼此之間的黏附力減少，然后誘導(dǎo)癌細(xì)胞表面生成只在正常細(xì)胞基底面表達(dá)的層粘連蛋白(LN)的高親和力受體，后者能與基底膜的LN分子定向附著。侵襲和遷移能力增加的原因可能是：(1)影響肌動蛋白的活性。以肌動蛋白為基礎(chǔ)的運動系統(tǒng)是細(xì)胞對外界刺激產(chǎn)生反應(yīng)的重要動力結(jié)構(gòu)，為目前公認(rèn)的腫瘤運動和轉(zhuǎn)移相關(guān)骨架蛋白。Youngs等[7]報道，乳腺癌細(xì)胞受趨化因子刺激后，細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白水平升高并發(fā)生聚合，細(xì)胞骨架蛋白重排，癌細(xì)胞朝趨化因子濃度梯度方向移動，并呈劑量、時間依賴性。(2)增強(qiáng)整合素的表達(dá)。整合素家族是一類重要的細(xì)胞黏附分子。黃濤等[8]報道，胰腺癌組織整合素β1表達(dá)顯著性增高，并與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和分化程度均相關(guān)，并證明其與胰腺癌細(xì)胞的增殖、分化、黏附、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。(3)E-鈣粘蛋白表達(dá)降低。鈣粘蛋白是一類重要的細(xì)胞黏附因子，介導(dǎo)同種細(xì)胞間相互黏附，參與形成和維護(hù)正常細(xì)胞間的連接，其中E-鈣粘蛋白與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切，其胞外結(jié)構(gòu)域與對側(cè)細(xì)胞上E-鈣粘蛋白的對稱部位連接，促進(jìn)細(xì)胞間的黏附。大量的實驗和臨床研究表明[9]，E-鈣粘蛋白具有抑制腫瘤細(xì)胞浸潤的作用，高侵襲腫瘤細(xì)胞與基底膜黏附能力升高同腫瘤細(xì)胞間同質(zhì)性黏附能力下降呈正相關(guān)，其表達(dá)缺失與腫瘤細(xì)胞的低分化和高侵襲力密切相關(guān)。(4)增加基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的分泌。Mckenna等[10]報道，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰頭癌組織中MMP-2的表達(dá)較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織顯著性提高。Lu等[3]也報道rhCXCL16通過增加明膠酶的分泌增強(qiáng)對前列腺癌細(xì)胞株侵襲性的誘導(dǎo)。

本實驗研究表明，rhCXCL16通過誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1細(xì)胞對基質(zhì)黏附性、侵襲和遷移能力來增強(qiáng)癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力，為胰腺癌浸潤發(fā)展、基礎(chǔ)研究提供了新的思路，同時也為臨床胰腺癌的分子靶向治療提供了實驗依據(jù)。

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2009-03-09)

(本文編輯：呂芳萍)

EffectofCXCL16onthebiologicalbehaviorofhumanpancreaticcancercelllinePANC1

DUJie,JIANGTao,WANGXi-mo,ZHANGShu-yi.

DepartmentofGeneralSurgery,TianjinPeople'sHospital,Tianjin300121,China

DUJie,Email:huoliw@126.com

ObjectiveTo investigate the effect of CXCL16 on the biological behavior of human pancreatic cancer cells PANC1.MethodsExponentially growing PANC1 cells was exposed to different concentration of rhCXCL16 (50,100,200 mg/ml) and CXCL16 antibody for 4 h, and PANC1 without rhCLCL16 treatment was used as the control. The proliferation was determined by MTT method, adhesion rate was determined by Mqrtigel matrix, invasion and migration of PANC1 cells were assayed by Transwell chamber.ResultsAfter 100 ng/ml rhCXCL16 treatment, proliferation, adhesion rate, invasion and migration of PANC1 cells were 0.264±0.021, 991.4±8.6)%,1.246±0.216, 1.361±0.276, respectively; and the adhesion rate, invasion and migration were significantly higher than (20.6±3.2)%, 0.259±0.013, 0.199±0.008 in the control group (Plt;0.01),and without significant effect on proliferation. After 200 ng/ml rhCXCL16 treatment, proliferation, adhesion rate, invasion and migration of PANC1 cells were further improved.ConclusionsrhCXCL16 could enhance the ability of adhesion, invasion and migration of PANC1 cells.

Pancreatic neoplasms; Chemotactic factors; Cell proliferation; Cell adhesion; Cell invasion; Cell migration

胰腺癌是一種病情兇險、治愈率低、預(yù)后極差的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率在全世界呈上升趨勢，在

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.015

300121 天津，天津市人民醫(yī)院普外科(杜杰、江濤、王西墨)、消化科(張姝翌)

杜杰，Email:huoliw@126.com