組合化學(xué)的高通量合成策略

段梅莉

【摘 要】本文對一門新興的用于新藥開發(fā)的組合化學(xué)技術(shù)進行了簡要的歸納和總結(jié)。組合化學(xué)的高通量合成策略從合成方法學(xué)上歸納為三類方法:平行合成法、裂分合成法、集組式合成。并概括介紹了高通量合成的重要輔助因子固相載體技術(shù)和自動化技術(shù)。

【關(guān)鍵詞】組合化學(xué) 高通量合成 新藥開發(fā)

【中途分類號】O621.3 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】1673-8209(2009)11-0-03

20世紀(jì)80年代末興起的組合化學(xué)技術(shù)在新藥開發(fā)的過程中,在先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)優(yōu)化上取得了卓有成效的研發(fā)結(jié)果。組合化學(xué)所運用的高通量合成技術(shù)與傳統(tǒng)的有機合成有顯著的不同。如圖1所示,一般有機合成方法每次合成得到一個產(chǎn)物。高通量合成技術(shù)則是進行組合合成,用一個構(gòu)建模塊A與另一個構(gòu)建模塊B的n個單元同時進行一步反應(yīng),可以得到n個產(chǎn)物。用一個構(gòu)建模塊A的m個單元與另一個構(gòu)建模塊B的n個單元同時進行一步反應(yīng),則得到m×n個化合物;若進行Y步反應(yīng),則得到n×n×Y或m×n×Y個化合物。有人作過統(tǒng)計,一個化學(xué)家用組合合成在2～6周完成的工作量,相當(dāng)于十個化學(xué)家用傳統(tǒng)方法花費一年時間才能合成得到的化合物數(shù)目。由此可見,高通量合成大幅度提高了新化合物的合成效率,減少了時間和資金的消耗,成為繼20世紀(jì)末至今化學(xué)研究的一個熱點。

高通量合成可以分為固相組合合成和液相組合合成兩大類,組合化合物庫也相應(yīng)的分類為固相庫和液相庫。因此庫化合物的合成策略應(yīng)當(dāng)圍繞著這二大類組合合成展開進行。高通量合成從合成方法學(xué)上來說,可歸納為以下三種方式:平行合成法;裂分合成法;集組式合成。

1 平行合成法(Parallel synthesis)

也稱間隔平行式合成。間隔平行式合成的基本原理是一孔一化合物。與傳統(tǒng)有機合成的原理相似,通過空間隔開的整齊排列的反應(yīng)器皿來平行合成化合物。由于在特定區(qū)域可得到很純的化合物,因此化合物結(jié)構(gòu)測定容易,參數(shù)相對容易取得。該方法的特點是合成速度較快、化合物數(shù)目較大,可用于固相組合合成和液相組合合成中。平行合成法多使用96孔微量滴定板操作。平行合成法已成功用于抗菌化合物和神經(jīng)激肽-2拮抗劑類似物等化合物庫的制備。

當(dāng)化合物庫有許多生物活性化合物供篩選時,使用平行合成法最適合。因為平行合成法合成的化合物是一孔一化合物,單個化合物對新藥開發(fā)中先導(dǎo)化合物優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系研究(SAR)特別有價值。平行液相合成和平行固相合成均可快速、高效的合成出對應(yīng)大量單個化合物的液相庫和固相庫。固相庫的合成產(chǎn)量可以從納摩爾到毫摩爾不等,一般來說液相庫的產(chǎn)量較固相庫高?；衔飵烊萘吭趲浊б陨蠒r,多采用自動化裝置進行合成。

1.1 多針法(Polypin)

也稱多中心合成法,它是Geyson教授發(fā)明的用于多肽合成的一種96孔微量滴定板反應(yīng)裝置。該裝置每孔對應(yīng)使用長40mm,直徑4mm的聚乙烯小棒(針)固定在滴定板上進行操作。每個小棒承載的化合物量在100納摩爾-50微摩爾不等,可合成超過25mg的產(chǎn)物。這種多針合成反應(yīng)裝置已成功地用于口蹄疫病毒抗原體的免疫學(xué)研究上。

多針合成法的具體操作是,將浸在丙烯酸水溶液中的聚乙烯(PE)或聚丙烯(PP)小棒用γ射線照射,使針的表面活化。活化后的針被羧基所覆蓋。這些羧基與長鏈的結(jié)合分子連接后,就提供了既能增加反應(yīng)體系流動性又可以連接構(gòu)件的氨基基團。把不同的氨基酸溶液反應(yīng)試劑移到96孔微板的每個孔中,即可對每一根針進行獨立的合成反應(yīng)。在每步反應(yīng)完成后將小棒移開,在一個公共反應(yīng)器中對這些小棒同時進行樹脂珠的沖洗等純化操作。重復(fù)這些操作直至拿到理想化合物。對應(yīng)小棒上的目標(biāo)產(chǎn)物可通過切割分離到滴定板的每個孔中,就使得每個孔均含有一個單獨的化合物。使用連在針上的多肽進行生物活性測定時,可與多種靶分子進行結(jié)合試驗,操作可反復(fù)進行多達幾十次。

多針合成法是一種有效平行合成多肽的方法,尤其是以羧基或酰胺結(jié)尾的多肽。該法也可用以合成苯并二氮雜窧類有機小分子化合物庫。目前該技術(shù)正向著高負(fù)載量、多種官能團化的固相載體材料以及多樣性豐富的化學(xué)反應(yīng)方向發(fā)展。在先期為抗原位點研究進行的多肽合成中,多針合成法產(chǎn)生了非常大的影響,已成為最有價值的組合化學(xué)合成技術(shù)的標(biāo)志。

1.2 茶葉袋法(Tea-bag)

茶葉袋法是Houghten教授1986年發(fā)明的一種組合合成技術(shù)。該技術(shù)自使用以來,對探明激素分子活性片段有關(guān)的構(gòu)效關(guān)系研究、對蛋白質(zhì)片斷構(gòu)象的探察以及對RGD肽類似物的深入研究都顯示了很大的功效。

該方法的固相載體為常見的Merrifield聚苯乙烯樹脂,反應(yīng)容器為化學(xué)惰性的多孔PE小袋,袋子的大小尺寸約為15mm×22mm,茶葉袋網(wǎng)眼74um,可防止樹脂珠漏出,保證溶劑等可溶性物質(zhì)的出入。為了高通量合成大容量的多肽庫,節(jié)省時間和工作量,在相同的化學(xué)反應(yīng)步驟中,每一個反應(yīng)器內(nèi)可容納多個袋子,同時進行相同的反應(yīng),集中進行洗滌、脫保護和中和。再集中切除樹脂珠。根據(jù)茶葉袋的尺寸和樹脂珠的質(zhì)量,化合物庫每個產(chǎn)物的產(chǎn)量大約為7-15mg,多的可達100mg。使用這種集中進行共同反應(yīng)步驟的方法,在制備肽庫時大大提高了合成效率,使之成為組合合成的典型范例。

1.3 點陣法

該法是以纖維素紙片作為固相載體的合成技術(shù)。以纖維素為基質(zhì)的紙片具有多孔性和極性,可在篩選時避免出現(xiàn)非特異性蛋白結(jié)合的副作用。但其缺點是不耐受強酸環(huán)境,僅適合Fmoc保護方式的構(gòu)件。該合成反應(yīng)操作簡便,雖無制備意義,但其合成技巧可以與嫁接多針掃描法及超大規(guī)模固定化多肽合成技術(shù)相媲美。點陣法多肽庫的合成已用于對人體巨細胞病毒蛋白抗原決定簇的定位試驗。

點陣法斑點合成技術(shù)操作是,控制所用試劑的體積,選擇斑點的位置,使斑點布滿一張紙面而又不發(fā)生重疊。這些斑點對應(yīng)不同的多肽,可以用鉛筆標(biāo)記斑點。將結(jié)合分子接到紙上后,對每個斑點滴加相應(yīng)高濃度的氨基酸活化酯溶液,經(jīng)洗滌-脫保護-再洗滌處理,完成一個構(gòu)件的縮合。如此反復(fù)操作進行多肽的合成。用溴酚藍指示劑給紙片染色,通過觀察由藍到黃的顏色變化(游離的氨基被?；?來跟蹤反應(yīng)進程。

1.4 光印法(Light-directed parallel synthesis)

也稱超大規(guī)模固定化多肽合成(very large scale immobilized peptide synthesis, VLSIPS)。光印法是將固相合成技術(shù)與光敏式印刷技術(shù)結(jié)合為一體的一種高通量合成方法。它是平行合成中較為特殊的一種方法,其關(guān)鍵技術(shù)是對光不穩(wěn)定的保護基通過特殊位置的光照會選擇性的斷裂。該法可以在一張50um2的玻璃載片上合成出容量高達5萬的多肽或寡聚核苷酸的化合物庫。并且每種特定產(chǎn)物序列占據(jù)空間的一個特定區(qū)域。由于篩選是連在載體上進行,經(jīng)熒光顯色篩選識別出有生物活性化合物的結(jié)構(gòu),可由其所在位置得到確認(rèn),合成十分精確。該合成技術(shù)已用于內(nèi)啡肽的抗體合成篩選試驗。

2 裂分合成法(split-poll synthesis)

亦稱混合-裂分式合成、一珠一化合物(one-bead one-product, OBOP)。裂分合成法是最早也是至今應(yīng)用最廣泛的一種高通量組合合成技術(shù)。該法只需幾個反應(yīng)器即可構(gòu)成一個容量龐大的化合物庫,是合成大量不同化合物最常用的方法。裂分合成技術(shù)為藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供了充足的化合物資源,改變了傳統(tǒng)的單一合成/單一篩選的藥物研究格局。

裂分合成法只需幾個反應(yīng)器就可以產(chǎn)生一個化合物庫,圖2例示了三個構(gòu)建單元通過三步反應(yīng)的裂分合成。具體操作是,將固相載體樹脂珠分成數(shù)目相等的三部分,每一部分放在單獨的反應(yīng)器中,各部分獨自與不同的構(gòu)建單元A、B和C反應(yīng),這樣每一個樹脂珠就連接上了一個構(gòu)建單元。當(dāng)?shù)谝徊椒磻?yīng)完成后,將每個反應(yīng)器中的樹脂珠分成數(shù)目相等的三部分,并混合每一個反應(yīng)器中的樹脂珠成均等的三部分,爾后集中在一個器皿中進行常規(guī)的沖洗和脫保護程序。然后將每一部分樹脂珠放在單獨反應(yīng)器中獨自與不同的構(gòu)建單元A、B和C反應(yīng),這樣每一個樹脂珠就連接上了第二個構(gòu)建單元。如此反復(fù)直至庫容量達到了33=27個化合物。

裂分合成法合成的特點是OBOP,即每一個樹脂珠都連有一個單獨的化合物。因此,該法的組合化合物庫又稱為一珠一化合物庫。裂分合成法制得的化合物庫中產(chǎn)物的數(shù)目以幾何級數(shù)增長,N=bx(N為庫容量;b為構(gòu)建單元數(shù);x為合成步驟數(shù))。

用高效的編碼技術(shù)輔助進行裂分合成時,可以幾個小圓柱形反應(yīng)器為混分操作的基礎(chǔ)單元,每一個反應(yīng)器由微孔外壁將幾百粒樹脂珠和射頻記錄片包在其中,在合成反應(yīng)進行的同時輸入該構(gòu)件單元的射頻信號。因此合成完成后,通過解讀記錄片上的信號即可識別反應(yīng)器內(nèi)連在樹脂珠上的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)信息。每一個反應(yīng)器內(nèi)的所有樹脂珠上均連著同一產(chǎn)物,這樣得到的化合物庫稱其為一反應(yīng)器一化合物庫,即OVOP(one-vessel one-product)庫。

裂分合成法合成的庫化合物的生物活性篩選可以直接用樹脂珠上的化合物測試活性,更可靠的方法是用固相載體上切下的混合物溶液來測試。解纏繞過程是常用的一種對混合裂分合成化合物庫進行生物活性篩選的方法和手段。

3 集組式合成(pooling synthesis)

也稱混合試劑合成法。集組式合成的特點是對全部構(gòu)件進行有序排列并按一定形式編組。每一組含有多種不同的構(gòu)件,一組作為一種構(gòu)建單元投入合成。庫化合物組合合成的每一步反應(yīng)都是在構(gòu)建單元混合物的反應(yīng)器皿中進行。固相集組式合成得到的不是一珠一化合物庫,而是一珠一組甚至是一珠多組化合物庫。液相集組式合成得到的化合物庫,可以按組分布,每一組均含多種化合物。不管是固相庫合成還是液相庫合成,兩者都需要高效的編碼技術(shù)輔助進行,以備在其后的生物篩選中它們的結(jié)構(gòu)信息得到及時的識別。

集組式合成可歸納為正交編組法、索引編組法以及模板核心法三種形式的操作過程。集組式合成是發(fā)現(xiàn)藥物先導(dǎo)化合物最經(jīng)濟的方法。該方法實驗設(shè)備要求低,不必逐一合成組合庫中各個單組分,一般的實驗室即能進行合成操作。雖然該法簡易可行,但缺點也明顯,即組分越多,分析跟蹤及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)識別的難度越大。

4 固相載體技術(shù)

固相合成技術(shù)是高通量合成的核心內(nèi)容,該技術(shù)從20世紀(jì)60年代被Merrifield創(chuàng)造性地成功合成多肽以來,便得到了極大的重視。在國際醫(yī)藥企業(yè)的合力運作下,1990年代至今固相合成技術(shù)得到了蓬勃發(fā)展,基本形成了固相有機合成化學(xué)的獨立學(xué)科。而且固相合成技術(shù)遠未成熟,被認(rèn)為仍有極大的發(fā)展空間,現(xiàn)在的成果只是金山一角。有統(tǒng)計表明,與有機化學(xué)相關(guān)的排名前15位的國際期刊幾乎每一期均刊登與固相有機合成相關(guān)的論文。固相合成技術(shù)最基本的構(gòu)成要素就是固相載體。因此固相載體技術(shù)可以說是固相庫合成的基石。

4.1 功能樹脂

固相載體是在各種溶劑中不溶解但可溶漲的高聚物材料,即功能樹脂。高通量合成要求載體具有一定的化學(xué)穩(wěn)定性和機械強度;能夠與結(jié)合分子相連,但對庫合成中使用的反應(yīng)條件惰性,在需要時隨時方便斷開;能夠在結(jié)合分子上延續(xù)化合物的制備,延續(xù)的合成步驟不破壞載體,也不影響其它化學(xué)鍵。

隨著高分子材料的發(fā)展,基于交聯(lián)聚苯乙烯(PS)的高強度Merrifield樹脂、在極性非質(zhì)子溶劑中溶解度高,官能團保護、脫保護和切割條件更加溫和的聚酰胺樹脂以及可在水相中進行合成、對酶學(xué)研究意義重大的TentaGel(PS-PEG copolymer)樹脂等各類功能性樹脂材料被先后開發(fā)出來。任何功能樹脂均可以按合成的要求制成固相載體。固相載體從外形上可以分為樹脂珠、多針和薄片。

4.2 樹脂珠技術(shù)(bio-bead)

絕大多數(shù)的固相庫合成是通過樹脂珠技術(shù)來實施的。1g樹脂可以制成幾百萬個樹脂珠,按照“三倍多余”的原則,可以構(gòu)建一個10萬個產(chǎn)物的化合物庫。每個樹脂珠的直徑大約為100?m,可承載200pmol的化合物。樹脂珠的制備方法是,向單體有機相和交聯(lián)劑的混合水溶液中加入自由基引發(fā)劑,升溫啟動聚合反應(yīng),將微小液滴轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w球狀小珠子顆粒。其聚合反應(yīng)的要點是保證小珠體積均一。運用平行合成法、裂分合成法進行的組合合成均可得到每一個樹脂珠都連有一個單獨化合物的一珠一化合物庫,即OBOP(one-bead one-product)庫。

4.3 薄片技術(shù)(thin tag)

任何一種能在樹脂珠上進行的化學(xué)反應(yīng)均能在薄片上實施合成反應(yīng)。用PS樹脂制成的形似小餅干的薄片(chip),如四邊形、三角形、圓形、五角形和六角形的小薄片,它們有一定的強度和許多微孔,且有良好的溶脹性。由于較大的表面積,產(chǎn)物的上載量遠遠大于一粒樹脂珠,因此較有制備意義。運用裂分合成法組合合成可得到每片薄片上有一種產(chǎn)物的化合物庫,即OCOP(one-chip one-product)庫。

基于紙片的薄片可作為點陣法平行合成的載體。而基于玻片的薄片可作為光印法平行合成的載體。

4.4 固相膜技術(shù)

基于高聚物的薄片比紙片的化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定,因而可以承受更寬的化學(xué)反應(yīng)條件范圍。聚氟乙烯膜制成的高聚物薄片的點合成,其合成方法與紙片斑點技術(shù)相似,將膜表面用乙二胺衍生化后,便提供了帶有氨基的活化基團表面。將有Fmoc保護的丙氨酸活化酯溶液以規(guī)則的空間排布方式點到固相膜上,就得到了用于多肽合成的斑點。在點合成偶聯(lián)步驟之間,膜可被多次晾干-洗滌-再晾干,用哌啶溶液脫Fmoc保護,多肽的多種產(chǎn)物就集合在一張薄片上。

還有一種固相膜三明治合成技術(shù),是將兩張PP小片夾住樹脂珠,像三明治一樣,用一種低熔點的聚合物使珠子在膜操作及整個合成步驟中固定不動。運用裂分合成法組合合成可得到每張層狀載片上有一種產(chǎn)物的化合物庫,即OSOP(one-slide one-product)庫。由于每一張層狀載片上含有許多樹脂珠(可達幾千粒),則每一種產(chǎn)物的量相對較高,因此OSOP庫合成具有制備意義,比OBOP庫合成實用性高。

5 自動化合成技術(shù)

隨著生物化學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展,每天可篩選上萬個化合物生物活性的高通量篩選技術(shù)已經(jīng)被廣泛運用。當(dāng)組合化合物庫容量達到上千的規(guī)模時,在有限的時間里,完成人工合成和對生物靶點的篩選是一項十分艱巨的工作。因此庫化合物的自動化高通量合成技術(shù)便應(yīng)運而生,可以說這是為了跟上高通量篩選的步伐,而產(chǎn)生的一種快速、高效的合成技術(shù)。與該技術(shù)相配合,需要機器來完成的操作有,樹脂珠裝載、試劑的轉(zhuǎn)移、合成條件的控制、合成反應(yīng)的進行、化合物的分離、純化和結(jié)構(gòu)分析以及樹脂珠的切割等。顯然自動化高通量合成技術(shù)是一項繁雜有序的過程工程,它將有機化學(xué)、計算機技術(shù)以及信息和電氣自動化技術(shù)等多學(xué)科集于一體。

組合化學(xué)需要合成大量毫克級量的化合物來篩選。該特點使得利用高效小型機件和器械來處理大量樣品,成為節(jié)約省時最基本的前提。固相庫的平行合成法組合合成是自動化高通量合成技術(shù)取得成功運營的一個范例。滴定機器人等自動化機件被廣泛的使用在許多合成操作上。已知多肽和核酸的組合合成,目前已經(jīng)完全可以用自動平行合成儀來進行操作。但是自動化高通量合成技術(shù)水平仍然低于發(fā)展較為完善的高通量篩選。平行合成自動儀每天約產(chǎn)生1000～2000個化合物,而微量滴定板上的高通量篩選,可對特定的生物受體每天篩選1～5萬個化合物。

絕大多數(shù)的高通量合成是在10mg、10-20umol數(shù)量級的微反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)進行。微反應(yīng)器的普遍使用給組合合成和篩選策略帶來了根本的改變。微反應(yīng)器聯(lián)通了合成和篩選的直接整合,也提供了發(fā)現(xiàn)新藥化合物的更好方法。微反應(yīng)器與微尺度純化和高靈敏度分析設(shè)備緊密相連,毫微托板用于從微流量分離單元中直接收集樣品,直接轉(zhuǎn)移到生物分析單元。這樣整合的成套設(shè)備,使化合物合成后就用來篩選,設(shè)備中沒有儲存系統(tǒng)。

6 結(jié)束語

以上對新興的用于新藥開發(fā)的組合化學(xué)技術(shù)進行了簡要的歸納和總結(jié)。組合化學(xué)的高通量合成策略從合成方法學(xué)上可以歸納為三類方法:平行合成法、裂分合成法、集組式合成。本文還概括介紹了高通量合成的重要輔助因子固相載體技術(shù)和自動化技術(shù)。相信在不久的將來,最早用于新藥開發(fā)的高通量合成技術(shù)在我國相關(guān)的研發(fā)領(lǐng)域能得到較大的普及應(yīng)用。

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