人腦星形細(xì)胞瘤進(jìn)展過程中Rho/ROCK信號通路的可能作用

侯景輝， 曾 敬， 吳惠瑜， 張惠忠， 符 珈， 吳秋良

Rho/ROCK信號通路與腫瘤發(fā)生、侵襲與轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期調(diào)控及凋亡均有密切的關(guān)系[1]，已明確Rho蛋白幾乎存在于腫瘤形成的每個(gè)階段中，是很有前景的腫瘤治療靶點(diǎn)[2]，ROCK蛋白是目前在功能研究方面最為清楚的Rho下游靶效應(yīng)分子，與腫瘤血管生成、侵襲與轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系[3]。RhoA、RhoB、ROCK-1及ROCK-2是Rho/ROCK信號通路中的重要分子，目前有關(guān)Rho/ROCK信號通路與人腦星形細(xì)胞瘤關(guān)系的研究報(bào)道甚少，本研究應(yīng)用免疫組化法檢測Rho/ROCK信號通路在人腦星形細(xì)胞瘤和瘤旁腦組織中的表達(dá)，探討Rho與ROCK表達(dá)之間的關(guān)系，并觀察其與腫瘤的病理類型以及患者臨床資料之間的關(guān)系，可望為人腦星形細(xì)胞瘤的發(fā)生、分子病理分型和惡性程度分級找到一些新的提示。

1 材料與方法

1.1 材料 收集本校附屬醫(yī)院1998年1月至2003年1月經(jīng)手術(shù)后病理確診并存檔的人腦星形細(xì)胞瘤60例(瘤旁腦組織20例)，其中男38例，女22例，年齡10～67歲，平均年齡39.81歲，按WHO(2000)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級，星形細(xì)胞瘤低級別30例(Ⅰ級7例，Ⅱ級23例)，高級別30例[Ⅲ級12例，Ⅳ級(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)18例]，均為首發(fā)病例，術(shù)前未經(jīng)放療、化療及生物治療。

1.2 免疫組化 組織標(biāo)本經(jīng)甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，免疫組化法采用SP法，5 μm連續(xù)切片。RhoA購自Bioworld Technology Inc，USA；RhoB、ROCK-1及ROCK-2購自SANTA CRUZ Biotechnology, Inc，USA；SP、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。操作步驟按說明書進(jìn)行。設(shè)有陽性對照及PBS液代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 RhoA、RhoB、ROCK-1及ROCK-2蛋白表達(dá)以瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)清晰棕黃色著色為陽性細(xì)胞，首先根據(jù)陽性腫瘤細(xì)胞所占百分比分為5個(gè)等級：陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；再按染色強(qiáng)度打分：0分為無色，1分為淺棕色，2分為棕黃色，3分為棕褐色?？偡值乃惴椋宏栃约?xì)胞數(shù)所得分值乘以染色強(qiáng)度所得分值的乘積?？偡?～2分為陰性(-)，3～5分為陽性(+)，6～8分為次強(qiáng)陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)[4-5]。次強(qiáng)陽性和強(qiáng)陽性判定為高表達(dá)。陽性表達(dá)例數(shù)=(陽性+次強(qiáng)陽性+強(qiáng)陽性)的總例數(shù)；高表達(dá)例數(shù)=(次強(qiáng)陽性+強(qiáng)陽性)的總例數(shù)。陽性率=陽性表達(dá)例數(shù)/總例數(shù)；高表達(dá)率=高表達(dá)例數(shù)/總例數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS15.0(SPSS Inc，Chicago，IL)，臨床病理參數(shù)及RhoA表達(dá)組間陽性率比較采用兩組或多組二分類定量資料的χ2檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

RhoA蛋白表達(dá)與60例星形細(xì)胞瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系(見表1)。RhoA蛋白在20例瘤旁腦組織中表達(dá)為陰性(見圖1)。RhoA蛋白在低級別星形細(xì)胞瘤組中表達(dá)的陽性率為20.0%(6/30)，高表達(dá)率為10.0%(3/30)；高級別組的陽性率為80.0%(24/30)，高表達(dá)率為66.7%(20/30)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，RhoA蛋白的陽性率和高表達(dá)率：(1) 有從瘤旁腦組織→低級別星形細(xì)胞瘤→高級別星形細(xì)胞瘤遞增的趨勢；(2) 瘤旁腦組織和低級別組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；(3) 在高級別和低級別組間的差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 RhoA蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

*腦組織vs低級別星形細(xì)胞瘤；**腦組織vs高級別星形細(xì)胞瘤；***低級別星形細(xì)胞瘤vs高級別星形細(xì)胞瘤。

圖1 瘤旁正常腦組織和星形細(xì)胞瘤中RhoA、RhoB、ROCK-1及ROCK-2的表達(dá)。A為RhoA在高級別星形細(xì)胞瘤中胞漿染色強(qiáng)陽性，B為RhoA在低級別星形細(xì)胞瘤中胞漿染色陽性，C為RhoA在瘤旁正常腦組織中染色陰性，D為RhoB在高級別星形細(xì)胞瘤中染色陰性，E，F(xiàn)分別為ROCK-1，ROCK-2在瘤旁正常腦組織中染色陰性。(×400)

RhoA蛋白表達(dá)在>40歲組的陽性率和高表達(dá)率分別為70.8%(17/24)、58.3%(14/24)，均顯著高于<40歲組的36.1%(13/36)、25.0%(9/36)，兩者差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； RhoA在右大腦半球發(fā)生組的高表達(dá)率為51.5%(17/33)顯著高于左大腦半球組的22.2%(6/27)，差別也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RhoA蛋白表達(dá)的陽性率和高表達(dá)率與性別、腫瘤最大徑無關(guān)(P>0.05)。

RhoB、ROCK-1及ROCK-2蛋白在60例星形細(xì)胞瘤及20例瘤旁腦組織中表達(dá)均為陰性。

3 討論

Rho/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵信號分子包括Rho蛋白、Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiled coil forming protein kinase,ROCK)和肌球蛋白磷酸酶。Rho蛋白又稱小G蛋白，是通過激活其下游靶分子——ROCK，以調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種行為與功能，包括收縮、游走粘附、生長分裂以及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與浸潤等。Rho蛋白家族至少包括Rho(RhoA， RhoB，RhoC)，Rac(Rac1，Rac2，Rac3，RhoG)，Cdc42(Cdc42H，G25K，TC10)， Rnd(RhoE/Rnd3， Rnd1/Rho6，Rnd2/Rho7)，RhoD和TTF。ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，以兩種同源性極高的異構(gòu)體形式存在(Rokβ/Rock1和Rokα/Rock2)。ROCK接受Rho傳遞的活化信號，發(fā)生多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的磷酸化而激活，并介導(dǎo)其下游的一系列磷酸化-脫磷酸化反應(yīng)。

RhoA在多種腫瘤的發(fā)展中具有重要意義，如肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌中的表達(dá)都是上調(diào)的[6]。RhoA的表達(dá)水平與乳腺癌的病理組織分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),可作為乳腺癌重要的預(yù)后指標(biāo)[7]，其與睪丸生殖細(xì)胞腫瘤病情進(jìn)展過程亦呈正相關(guān)[8]。RhoB是Rho家族中一個(gè)較特殊的成員，他是一個(gè)腫瘤的負(fù)性調(diào)節(jié)基因，RhoB雖然與RhoA堿基序列同源性很高，但卻在很多方面發(fā)揮著與RhoA不同的作用。RhoB在正常上皮和早期腫瘤中容易檢測到,而在侵襲性腫瘤中測不到[9]，如正常上皮和原位頭頸部腫瘤中有RhoB的蛋白表達(dá)，但低分化和轉(zhuǎn)移的人頭頸部癌中RhoB的表達(dá)則是缺失的[10]。有研究顯示, RhoB具有抗腫瘤活性,在黑色素瘤中,過表達(dá)RhoB反而抑制其遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。RhoB在人類腫瘤細(xì)胞的過表達(dá)能夠誘導(dǎo)凋亡,并抑制腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長[12]。這些資料說明，不同的Rho蛋白在腫瘤的發(fā)生過程中行使了不同的功能。

ROCK-Ⅰ的活化可顯著增強(qiáng)多種腫瘤細(xì)胞的侵襲能力,而以ROCK-Ⅰ顯性失活突變體或ROCK-Ⅰ抑制劑封閉ROCK-Ⅰ的功能時(shí),可通過多種方式抑制腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)不同級別人腦星形細(xì)胞瘤組織中Rho/ROCK信號通路中的RhoA、RhoB、ROCK-1及ROCK-2蛋白表達(dá)不同，人腦星形細(xì)胞瘤組織中RhoA的表達(dá)高于瘤旁腦組織，且在高級別組的表達(dá)顯著高于低級別組，兩者的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可見RhoA表達(dá)的強(qiáng)弱在一定程度上反映了人腦星形細(xì)胞瘤的發(fā)生、進(jìn)展與惡性程度。本研究中RhoB、ROCK-1及ROCK-2蛋白在60例星形細(xì)胞瘤及20例瘤旁腦組織中表達(dá)均為陰性，提示在人腦星形細(xì)胞瘤發(fā)病及惡性進(jìn)展過程中Rho/ROCK信號通路，可能不是通過RhoA/ Rock1 、RhoA/ Rock2、RhoB/ Rock1及RhoB/ Rock2這4條信號通路來發(fā)揮作用，而有可能通過與RhoA相關(guān)的某個(gè)信號通路起作用，如Rac/ Cdc42/PA K和Rho/ NF-kB等在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及侵襲中起作用。

另外，我們在研究中發(fā)現(xiàn)，RhoA蛋白表達(dá)在>40歲組的陽性率和高表達(dá)率分別為70.8%、58.3%，均顯著高于<40歲組的36.1%、25.0%，兩者差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；這可能意味著RhoA蛋白在年齡>40歲組星形細(xì)胞瘤的發(fā)生及惡性進(jìn)展過程中的作用不同于<40歲組，人腦星形細(xì)胞瘤的發(fā)生及惡性進(jìn)展機(jī)制可能與不同年齡組別相關(guān)，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

RhoA在右大腦半球組的高表達(dá)率為51.5%，顯著高于左大腦半球組的22.2%，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這提示高表達(dá)率在有功能區(qū)多的左大腦半球低于有功能區(qū)少的右大腦半球。RhoA蛋白的高表達(dá)可能與人腦星形細(xì)胞瘤發(fā)生部位的功能區(qū)的多少有關(guān)，其關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。由此我們推想RhoA在人腦星形細(xì)胞瘤的發(fā)生及其惡性進(jìn)展過程中發(fā)揮一定的作用，可能是一個(gè)重要的腫瘤相關(guān)基因，在人腦星形細(xì)胞瘤的發(fā)生、進(jìn)展和分子病理分型與分級中可能有參考價(jià)值,并有望為衡量膠質(zhì)細(xì)胞瘤生物學(xué)行為惡性轉(zhuǎn)化提供結(jié)構(gòu)性標(biāo)志。

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