馬鈴薯抗青枯病相關(guān)基因的研究進(jìn)展

樊娜娜 郭 曉 劉生祥 楊 煜 張柏順 范仲學(xué) 李廣存

摘 要:馬鈴薯是重要的糧菜兼用作物,但其受青枯病的影響嚴(yán)重,一直以來(lái)沒(méi)有根本的防治措施。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,利用基因工程技術(shù)研究抗青枯病相關(guān)基因的功能,進(jìn)而進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,培育抗病品種(系)將成為一條經(jīng)濟(jì)有效的途徑。本文在前期研究的基礎(chǔ)上對(duì)幾種抗青枯病相關(guān)基因的研究進(jìn)展、RNAi技術(shù)在研究基因功能中的作用以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的應(yīng)用等進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞:馬鈴薯;青枯病;基因;RNAi

中圖分類號(hào):Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2009)12-0012-05

馬鈴薯原產(chǎn)于南美洲的秘魯和玻利維亞等地,后在世界各地廣泛種植,是重要的糧菜兼用作物,單位面積產(chǎn)量高,營(yíng)養(yǎng)豐富,用途廣泛,經(jīng)濟(jì)價(jià)值高,抗旱性好,耐貯藏。目前馬鈴薯在我國(guó)的種植面積和產(chǎn)量均居世界首位。近幾年,隨著種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整及西部大開發(fā)戰(zhàn)略的實(shí)施,馬鈴薯正成為我國(guó)許多省及自治區(qū)的經(jīng)濟(jì)作物和優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè),種植面積也逐漸擴(kuò)大。馬鈴薯青枯病是由青枯病菌(也叫茄科雷爾氏菌,即Ralstonia solanacearum)引起的一種細(xì)菌性土傳病害,寄主范圍廣,涉及50多個(gè)科的數(shù)百種植物[1]。該病目前還沒(méi)有有效的防治措施,化學(xué)藥劑防治易造成環(huán)境污染和病原菌抗性小種突變,農(nóng)業(yè)綜合防治效果有限。選育抗青枯病品種是最為經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一,然而,迄今為止,尚未在馬鈴薯栽培種中發(fā)現(xiàn)有效的青枯病抗源。研究發(fā)現(xiàn),二倍體馬鈴薯野生種中存在青枯病抗源,但由于青枯病抗性機(jī)制復(fù)雜,存在寄主、環(huán)境、病原小種的互作效應(yīng)等,人們對(duì)青枯病的抗性機(jī)制仍然知之甚少。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,克隆抗病基因并進(jìn)行同源基因轉(zhuǎn)化,培育抗病品種已成為一條重要而有效的途徑,例如抗蟲棉的獲得等。因此本文對(duì)獲得的幾個(gè)抗青枯病相關(guān)基因的研究進(jìn)展及基因功能驗(yàn)證方法進(jìn)行了綜述。

1 馬鈴薯抗病相關(guān)基因的研究進(jìn)展

1.1 編碼蛋白激酶的基因

蛋白激酶是通過(guò)催化蛋白質(zhì)磷酸化進(jìn)而改變其活性的一類酶,這類酶以ATP 或GTP 作為磷酸基團(tuán)的供體,并將磷酸基轉(zhuǎn)移到底物中特定的氨基酸殘基上。根據(jù)蛋白激酶磷酸化底物中氨基酸殘基的不同,可將真核生物中的蛋白激酶分為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶( STK) 和酪氨酸蛋白激酶( PTK)兩大類,這兩類蛋白激酶功能域相似,但卻具有各自特征性的氨基酸序列區(qū)段,從而決定它們催化底物的特異性[2]。

1.1.1 植物蛋白激酶的功能

植物中的蛋白激酶幾乎與所有的發(fā)育過(guò)程有關(guān),在發(fā)育、自交不親和、雄性不育、抗逆和抗病等生命活動(dòng)過(guò)程中均起著重要的調(diào)控作用[3]。蛋白質(zhì)磷酸化與去磷酸化過(guò)程在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用,是生物體中普遍存在的一種調(diào)節(jié)機(jī)制。許多比較復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)都牽涉到瀑布式的由多個(gè)蛋白激酶所催化的磷酸化反應(yīng),從而使最初感受到的信號(hào)得到放大[4]。以往人們對(duì)蛋白激酶的了解絕大部分來(lái)自動(dòng)物和酵母,植物蛋白激酶的研究起步較晚,但進(jìn)展很快。動(dòng)物蛋白激酶的絕大多數(shù)種類已在植物中發(fā)現(xiàn)。研究表明,植物中的蛋白激酶大都屬于絲/蘇氨酸類蛋白激酶。如水稻抗白葉枯病基因Xa21[5] 和Xa26[6都編碼具有LRR 區(qū)的絲/蘇氨酸激酶。水稻抗稻瘟病基因Pi2d2[7]編碼的蛋白質(zhì)胞外是B凝集素(B-lectin) 結(jié)構(gòu),胞內(nèi)是絲/蘇氨酸激酶區(qū)。Sasabe等[8]從煙草中分離的3個(gè)NtlecRK能被激發(fā)子(elicitor) 誘導(dǎo),N端是豆凝集素結(jié)構(gòu)域,有跨膜區(qū),C端是絲/蘇氨酸類型的激酶結(jié)構(gòu)域。擬南芥的FLS2基因編碼含LRR 結(jié)構(gòu)域的類受體激酶,在植物抗病和病原菌識(shí)別中起重要作用[9]。大麥的Rpg1基因編碼的蛋白激酶具有抗銹病的功能[10]。不僅如此,某些植物特有的蛋白激酶研究也取得了進(jìn)展。如TDY類絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 有60～80個(gè)氨基酸的N端KD區(qū),有些具有C端CD區(qū)作為MAPKK、磷酸酶和底物蛋白的停泊位點(diǎn)[11]。TDY類MAPK的功能主要與機(jī)械性傷害、紫外線脅迫、H2O2 脅迫及重金屬脅迫等各種環(huán)境脅迫相關(guān)。TDY類MAPK相對(duì)于其它類的MAPK在進(jìn)化上是相對(duì)獨(dú)立的,具有多個(gè)起源。

1.1.2 植物蛋白激酶中的類受體激酶

與動(dòng)物中的受體激酶類似,植物中的蛋白激酶是一類定位在質(zhì)膜上,包含胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶域的膜蛋白[12]。這類蛋白激酶的分子結(jié)構(gòu)和功能類似動(dòng)物細(xì)胞中的受體蛋白激酶(receptor protein kinase, RPK),且絕大多數(shù)尚未鑒定出其配基,故稱之為類受體蛋白激酶(receptor-like protein kinases, RLKs)[13]。不同類受體激酶胞外受體結(jié)構(gòu)的差異較大,據(jù)此,可將植物類受體激酶細(xì)分為6個(gè)亞家族[14]:(1) 具S結(jié)構(gòu)域( S-domain) 的RLK (S-RLK) :其胞外受體部分具有同油菜自交不親和糖蛋白相似的S結(jié)構(gòu)域; (2) 富含亮氨酸(leucine-rich repeat) 的RLK(LRR- RLK) :具有重復(fù)出現(xiàn)的富含亮氨酸的胞外結(jié)構(gòu)域,在分子識(shí)別中起重要作用,目前發(fā)現(xiàn)的類受體激酶大多屬于這一類;(3) 類腫瘤壞死因子受體( tumor-necrosis factor receptor, TNFR) RLK:其胞外受體部分具有特定排列的6個(gè)半胱氨酸;(4) 類表皮生長(zhǎng)因子( epidermal growth factor, EGF) RLK:這個(gè)亞家族的成員具有類似EGF的結(jié)構(gòu)域;(5) PRLK (pathogenesis related protein):該類成員具有PR5相似的結(jié)構(gòu);(6) 類凝集素(lectin) RLK:其受體部分具有與胞外凝集素相似的結(jié)構(gòu)域。

隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn):植物類受體激酶能夠在質(zhì)膜感知外界信號(hào)刺激,并傳導(dǎo)至胞內(nèi),從而引發(fā)一系列的生理生化反應(yīng),成為植物正常生長(zhǎng)發(fā)育和抵抗病原菌侵?jǐn)_不可缺少的參與成員[15],如LRR-RLK參與蛋白-蛋白互作,在分子識(shí)別過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[16]; S-RLK與植物的自交不親和有關(guān),是自交不親和反應(yīng)中雌蕊一方的重要因子, S-RLK基因發(fā)生突變可導(dǎo)致自交不親和性喪失[17];擬南芥的RPK1是位于質(zhì)膜上的一種LRR 受體激酶,在ABA 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起主要作用[18]。本實(shí)驗(yàn)室所研究的RHG1類受體激酶屬于富含亮氨酸的RLK,該受體激酶基因受青枯病菌的誘導(dǎo),但不受茉莉酸(JA)的調(diào)節(jié),推測(cè)該受體激酶可能作為受體參與了信號(hào)識(shí)別和抗青枯病反應(yīng)。

1.2 編碼果膠甲酯酶抑制子的基因

果膠是植物細(xì)胞壁的主要成分,最初是以高度甲酯化的形式被分泌出來(lái),被果膠甲酯酶去甲酯化后進(jìn)入細(xì)胞壁。果膠甲酯酶對(duì)植物發(fā)育具有重要的作用[19]。果膠甲酯酶活性的調(diào)控受多種因素的影響,果膠甲酯酶抑制子是其中重要的影響因素。自Balestrieri等[20]在研究獼猴桃果膠甲酯酶的特性時(shí)發(fā)現(xiàn)一種對(duì)果膠甲酯酶有抑制作用的蛋白后,在土豆汁液、香蕉果實(shí)和無(wú)花果中均發(fā)現(xiàn)對(duì)果膠甲酯酶有抑制作用的物質(zhì),這些物質(zhì)統(tǒng)稱為果膠甲酯酶抑制劑[21]。果膠甲酯酶抑制子(Pectin methylesterase inhibitors, PMEIs)通過(guò)作用于果膠甲酯酶(PME)形成1∶1的非共價(jià)可逆復(fù)合體而起作用,這種復(fù)合體的穩(wěn)定性受pH值的強(qiáng)烈影響,二者的親和力隨pH值的降低而升高,致使PME的活性受到抑制。同時(shí)pH值的降低也使得細(xì)胞中的糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶被激活,而糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)于細(xì)胞壁的擴(kuò)展和建立具有重要作用[22],這預(yù)示著PME的活性可以通過(guò)直接調(diào)節(jié)pH值及PME與PMEI的親和力來(lái)實(shí)現(xiàn)[23]。An等[24]從辣椒中分離和鑒定了CaPMEI1基因,該基因在發(fā)生葉枯病的辣椒葉片中編碼一種果膠甲酯酶抑制子。重組基因CaPMEI1編碼的蛋白不僅抑制PME,而且可作為某些植物病原菌的抗體。在辣椒中,病毒誘導(dǎo)該基因沉默使得辣椒對(duì)Xcv(辣椒斑點(diǎn)病細(xì)菌)的敏感性增加,并且一些防御相關(guān)基因的表達(dá)量也減少。這些結(jié)果表明,該基因除了參與抗旱和抗氧化脅迫之外,還參與基本的抗病防御。本實(shí)驗(yàn)室自馬鈴薯中獲得的StPMEI基因的表達(dá)受青枯病菌侵染的抑制,這可能會(huì)導(dǎo)致因PMEI的量不足而無(wú)法形成足夠的非活性狀態(tài)的PME∶PMEI復(fù)合物,從而使PME表現(xiàn)出活性,通過(guò)催化產(chǎn)生的具有非酯化的羧基基團(tuán)與細(xì)胞中Ca2+作用形成不溶性的果膠酸鹽,加固細(xì)胞壁達(dá)到早期防御病原侵染的目的。同時(shí)該基因又受JA的誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá),推測(cè)這可能會(huì)使得PME以非活性PME∶PMEI復(fù)合物的形式存在,引起細(xì)胞內(nèi)pH值的降低,最終使得細(xì)胞中的糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶被激活,這對(duì)于細(xì)胞壁的擴(kuò)展和建立具有重要的作用。影響PME活性的因素較為復(fù)雜,PMEI究竟如何通過(guò)抑制PME而起作用尚不十分清楚,有關(guān)該研究所獲得的StPMEI基因在馬鈴薯中所扮演的角色正在進(jìn)一步研究中。

1.3 編碼蛋白酶抑制子的基因

蛋白酶抑制子是一類廣泛存在于植物中的蛋白質(zhì),是植物體內(nèi)自然存在的病程相關(guān)蛋白,當(dāng)植物受到病原侵襲時(shí)這些基因被激活從而賦予植物自然抵抗能力[25],其主要通過(guò)抑制參與致病過(guò)程的外來(lái)病原的蛋白酶或消化酶活性,從而導(dǎo)致病原缺乏必需氨基酸的供應(yīng)而達(dá)到抗病的目的[26]。利用蛋白酶抑制子基因,特別是源自植物的抑制子基因進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移創(chuàng)造具有抗病蟲性的工程植株,具有廣闊的前景,如轉(zhuǎn)Vigna unguiculata的胰蛋白酶抑制子基因的煙草植株具有對(duì)病蟲的廣譜抗性[27]。目前自然界共發(fā)現(xiàn)4大類蛋白酶抑制劑[28]:絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、天冬氨酸蛋白酶抑制劑和金屬蛋白酶抑制劑。李廣存等[29]以馬鈴薯高抗青枯病基因型ED13為材料,利用cDNA-RGA方法獲得了Kunitz型蛋白酶抑制子基因片段,生物信息學(xué)的分析表明,該基因是馬鈴薯半胱氨酸蛋白酶抑制子基因家族的重要成員,進(jìn)一步的半定量RT-PCR分析表明該基因受青枯病的誘導(dǎo),推測(cè)可能參與了馬鈴薯的抗病防御。

2 RNAi技術(shù)的應(yīng)用

RNAi(RNA干擾)技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的研究特定基因功能的新技術(shù),具有定向、高效、快速、序列特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),已成功運(yùn)用于植物、真菌和脊椎動(dòng)物等生物體的功能研究中,并為植物基因功能研究提供了一條嶄新的思路。最初研究植物中RNAi現(xiàn)象的試驗(yàn)是在馬鈴薯中通過(guò)PTGS(轉(zhuǎn)錄后基因沉默)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗RNA病毒的能力及在水稻中使報(bào)告基因GUS沉默的能力來(lái)比較正義鏈、反義鏈及dsRNA誘導(dǎo)RNAi效率的高低,結(jié)果兩個(gè)試驗(yàn)都得出同樣的結(jié)論,即dsRNA比正義鏈、反義鏈更能有效誘導(dǎo)目的基因的沉默[30]?，F(xiàn)在水稻和擬南芥的基因組測(cè)序已經(jīng)完成,人們獲得了大量候選基因,同時(shí)其它植物的基因組測(cè)序和各種EST (Expression Sequence Tag) 的測(cè)序工作也正在進(jìn)行。這些植物基因組和EST序列信息的獲得及測(cè)序技術(shù)的不斷提高使得人們迫切需要一種高效、高通量方法來(lái)研究植物基因的功能。RNA干擾技術(shù)為分析這些基因功能提供了一種快速、高效的途徑,并已取得大量進(jìn)展[31,32]。此外,Fairbaim等[33]構(gòu)建了根結(jié)線蟲(Meloidogyne javanica)靶基因MjTisl1不同發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi質(zhì)粒,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入煙草植株,獲得表達(dá)不同hpRNA結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果表明,寄生于轉(zhuǎn)基因煙草植株的線蟲體內(nèi)的MjTisl1基因被持續(xù)沉默,而且這種基因沉默是MjTisl1特異的,線蟲體內(nèi)其它不相關(guān)的基因序列不受任何影響。該研究證實(shí)了通過(guò)在寄主植株中表達(dá)靶基因dsRNA能夠沉默根結(jié)線蟲的相應(yīng)基因。這種方法不僅可用于抗寄生線蟲的研究,也適合其它以食植物為生的害蟲。在植物和線蟲中,RNA沉默也能產(chǎn)生通過(guò)細(xì)胞邊界相互傳遞的系統(tǒng)信號(hào)[34]。該策略的應(yīng)用有助于更好地理解植物寄生線蟲的功能基因組,更好地防治病原和可能的其它一些昆蟲病害。郭新梅等[35]用基因槍將構(gòu)建好的sbeIIb RNAi表達(dá)載體pBAC413導(dǎo)入玉米(Zeamays)自交系中,對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因玉米籽粒淀粉含量的測(cè)定結(jié)果表明:總淀粉含量與對(duì)照相比沒(méi)有顯著變化,但其中一個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米株系的直鏈淀粉含量比對(duì)照提高了15.6%。為了鑒定我們所獲得的幾個(gè)馬鈴薯抗青枯病相關(guān)基因的功能,本實(shí)驗(yàn)室分別利用馬鈴薯果膠甲脂酶抑制子基因(StPMEI)、蛋白酶抑制子基因(StPI)、類受體激酶基因(StRLK)及轉(zhuǎn)錄因子基因(StTF)的特異片段構(gòu)建了RNA干擾表達(dá)載體,并進(jìn)行了基因轉(zhuǎn)化,現(xiàn)已獲得了再生植株,再生植株的表型鑒定工作正在進(jìn)行中。

3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究進(jìn)展

建立高效的植物再生轉(zhuǎn)化系統(tǒng),是遺傳轉(zhuǎn)化成功的前提和保障。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法由于具有費(fèi)用低、能轉(zhuǎn)移大片段DNA、外源基因拷貝數(shù)低并能穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞。農(nóng)桿菌是從土壤中分離出來(lái)的革蘭氏陰性細(xì)菌,根據(jù)宿主范圍和致病癥狀可分為5種[36],其中研究最多也最透徹的是根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens),它能將自身Ti質(zhì)粒的一段DNA(T-DNA)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中,從而使植物損傷部位形成冠癭瘤。由于T-DNA轉(zhuǎn)化不具有序列特異性,因此可用任何感興趣的基因來(lái)代替內(nèi)源的T-DNA基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化[37]。自1983年首次通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得馬鈴薯再生植株至今,國(guó)內(nèi)已獲得了不少的馬鈴薯品種轉(zhuǎn)化植株,如轉(zhuǎn)基因中薯1號(hào)、中薯3號(hào)、東農(nóng)303、大西洋、費(fèi)烏瑞它、布爾班克、黃麻子等,并得到了一些抗晚疫病、青枯病及抗旱的轉(zhuǎn)基因植株[38～40]。在外植體的選擇、不同轉(zhuǎn)化條件等方面人們也進(jìn)行了大量探索,并建立了多種遺傳轉(zhuǎn)化體系。本實(shí)驗(yàn)室在研究青枯病抗性相關(guān)基因的功能時(shí),也建立了二倍體馬鈴薯基因型ED13和ED25的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系,并獲得了多個(gè)馬鈴薯抗青枯病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因再生植株,為進(jìn)一步驗(yàn)證這些基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

4 展望

LRR-RLKs同時(shí)具有胞外LRR區(qū)和胞內(nèi)激酶區(qū)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),使其成為植物信號(hào)分子傳導(dǎo)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),越來(lái)越多的研究資料表明,LRR-RLKs在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和防衛(wèi)反應(yīng)中起著重要作用。但仍有很多問(wèn)題尚未解決,如在所有被發(fā)現(xiàn)的LRR-RLKs中,只有擬南芥BRI家族和CLV1家族成員的生化功能和作用方式研究的較為透徹,絕大部分的LRR-RLKs的功能和作用方式還知之甚少。這可能是因?yàn)?(1)植物信號(hào)傳導(dǎo)的復(fù)雜性。網(wǎng)絡(luò)狀的信號(hào)傳導(dǎo)模式導(dǎo)致多條傳導(dǎo)途徑的交叉;(2)不同蛋白功能的互補(bǔ),導(dǎo)致某個(gè)基因突變體表型的恢復(fù),難以獲得該基因的正常功能。今后的研究必將加強(qiáng)對(duì)LRR-RLKs配體和下游信號(hào)分子的搜尋、鑒定和識(shí)別,致力于構(gòu)建每一小段信號(hào)傳導(dǎo)鏈,為今后整個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建打下基礎(chǔ)。

果膠甲酯酶抑制劑除在植物果膠甲酯酶的活性調(diào)控方面發(fā)揮重要作用外,在果蔬汁加工業(yè)中也具有廣闊的應(yīng)用前景。一般認(rèn)為,果膠甲酯酶抑制劑對(duì)植物果膠甲酯酶的抑制作用為后轉(zhuǎn)錄調(diào)控[21]。在植物體中,已發(fā)現(xiàn)許多果膠甲酯酶同工型,但目前所獲得的果膠甲酯酶抑制劑的同工型還很少。隨著植物體內(nèi)果膠甲酯酶抑制劑同工型的不斷發(fā)現(xiàn),對(duì)果膠甲酯酶活性調(diào)控機(jī)理的研究將不斷深入,這將進(jìn)一步促進(jìn)對(duì)植物成熟衰老過(guò)程的研究。

RNAi作為關(guān)閉特定基因功能的新技術(shù),為基因功能的研究提供了一個(gè)快速、簡(jiǎn)便的方法。它的發(fā)現(xiàn)激起了世界范圍內(nèi)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室探索基因功能的興趣,成為研究基因功能的最有用的工具之一。RNAi技術(shù)的應(yīng)用方興未艾,隨著植物資源的廣泛開發(fā),相信RNAi技術(shù)將為人類探索自然做出更大的貢獻(xiàn)。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是一種應(yīng)用較多的基因轉(zhuǎn)化方法。多年來(lái)人們一直致力于影響轉(zhuǎn)化率各個(gè)方面的研究,包括基因型、外植體、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、侵染和共培養(yǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌菌株、載體以及篩選劑等。雖然已經(jīng)獲得了一些高效的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系,但仍有許多問(wèn)題亟待解決,如轉(zhuǎn)化率仍然不高、轉(zhuǎn)化受基因型的限制等,今后在此方面的探索將逐步增強(qiáng),這些問(wèn)題也將最終得到解決。

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