葛根總黃酮對大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠紅細(xì)胞抗氧化能力和ＡＴＰ酶活性影響的實(shí)驗(yàn)研究

熊正英　張　怡　李寶成

摘要：目的：探討葛根總黃酮對大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠紅細(xì)胞抗氧化能力及紅細(xì)胞膜ATP酶（ATPase）活性影響的機(jī)理。方法：建立大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練動物模型，測試大鼠紅細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶( GSH睵x)、過氧化氫酶(CAT)活性，還原型谷胱甘肽含量（GSH）和丙二醛(MDA)含量。結(jié)果：灌服葛根總黃酮組大鼠力竭運(yùn)動后紅細(xì)胞SOD、GSH睵x、CAT酶活性和GSH含量較顯著高于訓(xùn)練對照組（P<0.05）；MDA的含量極顯著低于訓(xùn)練對照組（P<0.01）；紅細(xì)胞膜ATPase活性較顯著高于訓(xùn)練對照組（P<0.05）。結(jié)論：葛根總黃酮可以改善長時(shí)間大強(qiáng)度耐力運(yùn)動中紅細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，保護(hù)膜上ATPase的活性，有利于運(yùn)動中紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性，可作為耐力運(yùn)動員的運(yùn)動補(bǔ)劑進(jìn)行深入的開發(fā)和利用。

關(guān)鍵詞：葛根總黃酮；耐力訓(xùn)練；紅細(xì)胞；抗氧化能力

中圖分類號：G804.7文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1007-3612(2008)02-0193-03

本實(shí)驗(yàn)就葛根總黃酮對大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠紅細(xì)胞產(chǎn)生的自由基清除效果和對紅細(xì)胞膜ATPase活性的保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，旨在闡釋葛根總黃酮保護(hù)運(yùn)性紅細(xì)胞損傷的機(jī)制，并為其應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與對象實(shí)驗(yàn)材料為太白野葛根，通過冷浸法［1］提取葛根總黃酮，然后用滅菌雙蒸水配制成濃度為150 mg/mL的懸浮液。

實(shí)驗(yàn)對象為SD雄性大鼠（由陜西中醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)中心提供）24只，體重180 g-220 g，兩月齡，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d并篩選出不能訓(xùn)練的異常大鼠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法將大鼠隨機(jī)分為安靜對照組（安靜組）、大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練組（訓(xùn)練組）和訓(xùn)練服藥組（訓(xùn)練服藥組）。按實(shí)驗(yàn)組分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度為25℃左右，濕度為(58.92±1．77)%，照明隨同自然變化。安靜組安靜飼養(yǎng)，自由飲食、攝水；訓(xùn)練組和訓(xùn)練服藥組于動物跑臺上先進(jìn)行5周的適應(yīng)性訓(xùn)練，然后進(jìn)行2周大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練。適應(yīng)性訓(xùn)練期間每天訓(xùn)練20 min，每周5d，坡度為0，跑速每周遞增，分別為15 m/min，22 m/min，27 m/min，31 m/min和35 m/min，共5周；強(qiáng)化訓(xùn)練期間每天訓(xùn)練30 min，每周7 d，坡度為0，速度為35 m/min，共2周。訓(xùn)練的同時(shí)服藥組大鼠每日早8:00用葛根總黃酮懸浮液灌胃，給藥量以500 mg/kg體重計(jì)算，每天0.8 mL灌服一次，對照組大鼠灌服同樣劑量的蒸餾水。

1.3取材及樣品制備

1.3.1取材力竭運(yùn)動后即刻，用20%烏拉坦（0.5 mL/kg體重）腹腔麻醉后，腹股靜脈采5 mL抗凝全血。

1.3.2樣品制備紅細(xì)胞的制備：取肝素抗凝全血1 500～2 000 rpm/min 4℃離心5 min，除去血漿和灰白色的白細(xì)胞層，按1:2體積加入生理鹽水，混合后反復(fù)洗滌3次，離心條件同上，除去上清夜留壓積紅細(xì)胞。分離好的紅細(xì)胞于-20℃冰箱凍存。

紅細(xì)胞膜樣品制備：取上述沉淀的紅細(xì)胞按1/10 (v/v)加入預(yù)冷的破膜液(0.1mmol/LEDTANa, 2.5 mmo1/L NaHPO4, 0.03 m mol/L PMSF, PH 7.4-8.0)，均勻攪拌2 min，待完全溶血后，以12 000 rpm/min 4℃離心10 min，將沉淀重復(fù)依上法再洗滌3次，棄去上清及離心管底部褐色的纖維狀沉淀物，收集乳白色的紅細(xì)胞膜樣品，取50μL用考馬斯亮蘭試劑做蛋白定量，將紅細(xì)胞膜用低滲液（破膜液）配成蛋白含量為2 mg/mL左右的懸液，將上懸液分裝到小容器中，-20℃冰箱凍存。

1.4測試指標(biāo)及方法谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、還原型谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、ATPase（超微量分型）各測試指標(biāo)均采用南京建成試劑盒進(jìn)行測試，測試方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件對所測數(shù)據(jù)進(jìn)行組間雙尾ｔ檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD) 來表示。

2結(jié)果

2.1葛根總黃酮對大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠紅細(xì)胞抗氧化能力的影響

注：▲代表安靜組與訓(xùn)練組比較，▲代表具有較顯著性差異（P<0.05），▲▲代表具有極顯著性差異（P<0.01）；#代表訓(xùn)練組與訓(xùn)練服藥組比較，#代表具有較顯著性差異（P<0.05），##代表具有極顯著性差異（P<0.01）。

由表1結(jié)果顯示，訓(xùn)練組大鼠在力竭運(yùn)動后，紅細(xì)胞抗氧化指標(biāo)SOD、CAT、GSH-Px活性以及GSH含量極顯著的低于安靜組（P<0.01），而紅細(xì)胞MDA含量相對安靜組有極顯著的升高（P<0.01）。訓(xùn)練服藥組大鼠在力竭運(yùn)動后，紅細(xì)胞抗氧化指標(biāo)SOD、CAT活性以及GSH含量較顯著的高于訓(xùn)練組（P<0.05），紅細(xì)胞GSH-Px活性極顯著的高于訓(xùn)練組（P<0.01），紅細(xì)胞MDA含量相對訓(xùn)練組有極顯著的下降（P<0.01）。訓(xùn)練服藥組大鼠在力竭運(yùn)動后，紅細(xì)胞抗氧化酶的活性都低于安靜組，而MDA的含量則顯著的高于安靜組水平。

2.2葛根總黃酮對大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠紅細(xì)胞膜ATPase活性的影響

由表2可以看出，訓(xùn)練組大鼠在力竭運(yùn)動后，紅細(xì)胞膜ATPase（Na+,K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase）活性極顯著的低于安靜組（P<0.01）。訓(xùn)練服藥組大鼠在力竭運(yùn)動后，紅細(xì)胞膜ATPase（Na+,K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase）活性都較顯著的高于訓(xùn)練組（P<0.05），其中Na+,K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性都較顯著的低于安靜組（P<0.05）。

3討論

3.1葛根總黃酮對大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠紅細(xì)胞抗氧化能力的影響及其機(jī)制探討

3.1.1葛根總黃酮對大鼠紅細(xì)胞SOD活性和MDA含量的影響及其機(jī)制探討本實(shí)驗(yàn)中訓(xùn)練組大鼠在力竭運(yùn)動后紅細(xì)胞SOD活性顯著地下降。這樣的結(jié)果提示，大強(qiáng)度的力竭性運(yùn)動使訓(xùn)練大鼠紅細(xì)胞內(nèi)量快速大量的增多，SOD也隨著被大量利用以催化的歧化反應(yīng)，與此同時(shí)這一反應(yīng)的產(chǎn)物H2O2也隨運(yùn)動而快速增加。H2O2可以破壞酶活性中心的金屬配位場結(jié)構(gòu)而引起酶失活［2］。紅細(xì)胞MDA含量也明顯升高，說明了紅細(xì)胞內(nèi)的自由基大量生成，致使自由基代謝失衡，紅細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷加劇。

訓(xùn)練服藥組大鼠在力竭運(yùn)動后，紅細(xì)胞SOD活性顯著高于訓(xùn)練組，而MDA含量顯著低于訓(xùn)練組的水平。說明葛根總黃酮可以保護(hù)大強(qiáng)度耐力運(yùn)動中紅細(xì)胞內(nèi)SOD的活性，降低紅細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。其機(jī)制可能與葛根總黃酮具有顯著的抗氧化功能有關(guān)。葛根總黃酮屬于多酚羥基化合物，可以通過酚羥基與自由基反應(yīng)生成較穩(wěn)定的半醌式自由基從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；再者其相鄰的羥基或羧基上的氧原子可以作為配位原子同金屬離子配合形成螯合物，也可與某些高價(jià)金屬離子如Fe3+等作用形成絡(luò)合物，把金屬離子從高價(jià)態(tài)還原至低價(jià)態(tài)［3,4］，從而保護(hù)長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動中紅細(xì)胞內(nèi)Hb的氧化還原狀態(tài)，有利于紅細(xì)胞的攜氧能力，提高大鼠的運(yùn)動能力。

3.1.2葛根總黃酮對大鼠紅細(xì)胞CAT、GSH-Px活性和GSH含量的影響及其機(jī)制探討在生理狀況下，紅細(xì)胞內(nèi)H2O2主要由CAT和GSH-Px催化的反應(yīng)來滅活。CAT可以直接將H2O2分解為H2O和O2，但H2O2的大量堆積也可抑制CAT活性［2］。還原型GSH在GSH-Px作用下與過氧化物反應(yīng)后成為氧化型GSSG，此氧化還原過程可以消耗過氧化物，降低過氧化物對細(xì)胞的損傷作用。大量研究表明，長時(shí)間大強(qiáng)的耐力運(yùn)動可以使紅細(xì)胞內(nèi)GSH大量減少，GSH-Px活性下降，致使紅細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)的代謝速度減慢，最終導(dǎo)致紅細(xì)胞氧化損傷加?。?,6］。有人研究表明，一次性長時(shí)間耐力運(yùn)動訓(xùn)練，可使紅細(xì)胞的GSH水平下降［7,8］；在極限負(fù)荷運(yùn)動后即刻GSH下降30%。

從表1可以看出，訓(xùn)練組大鼠在力竭運(yùn)動后，紅細(xì)胞抗氧化指標(biāo)GSH、GSH-Px、CAT的值極顯著的低于安靜組。說明紅細(xì)胞內(nèi)H2O2大量堆積，GSH消耗大于合成，致使其含量顯著下降，從而影響了GSH-Px的活性，導(dǎo)致H2O2水平持續(xù)升高，紅細(xì)胞氧化損傷加劇。訓(xùn)練服藥組大鼠在力竭運(yùn)動后，紅細(xì)胞抗氧化指標(biāo)GSH、GSH-Px、CAT的值都顯著的高于訓(xùn)練組的水平。說明葛根總黃酮可以抑制大強(qiáng)度耐力運(yùn)動造成的紅細(xì)胞內(nèi)H2O2的過度堆積。蔣風(fēng)萍等［9］的實(shí)驗(yàn)表明，葛根總黃酮中的葛根素對體外黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶、H2O2和紫外線（UV）照射等三種自由基產(chǎn)生體系誘導(dǎo)細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)都有顯著的抑制作用。朱慶磊等研究表明，葛根總黃酮能抑制H2O2引起的紅細(xì)胞溶血反應(yīng)，并可抑制LPO產(chǎn)生。葛根總黃酮可以提高大運(yùn)動大鼠紅細(xì)胞CAT、GSH-Px活性和GSH含量，其機(jī)制可能與葛根總黃酮的多酚羥基化可以終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，防止紅細(xì)胞內(nèi)H2O2大量堆積，進(jìn)而保護(hù)了紅細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性，防止GSH的過度消耗，減輕了運(yùn)動中紅細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

3.2葛根總黃酮對大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠紅細(xì)胞膜ATPase活性的影響及其機(jī)制探討Na+,K+-ATPase是廣泛存在真核細(xì)胞膜上的內(nèi)在蛋白，Na+,K+-ATPase不對稱地鑲嵌在細(xì)胞膜內(nèi)，是一個依賴于磷脂，需要磷脂來維持其活性的酶［10］。紅細(xì)胞膜上的Na+,K+-ATPase的基本功能是將細(xì)胞內(nèi)的Na+轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，將細(xì)胞外的K+運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡和跨膜電位梯度。Ca2+-ATPase不僅對維持膜脂的不對稱分布有主要作用，并維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高可影響膜蛋白相互作用，降低紅細(xì)胞膜粘彈性，并使紅細(xì)胞膜脂質(zhì)和膜骨架蛋白分離，使膜的穩(wěn)定性和流動性降低，從而影響了細(xì)胞的正常功能［11］。Hespel等［12］研究表明，長期有氧運(yùn)動的運(yùn)動員，其靜息狀態(tài)紅細(xì)胞膜內(nèi)K+顯著升高，而細(xì)胞內(nèi)Na+、Mg2+含量及Na+,K+-ATPase活性無變化。另有研究發(fā)現(xiàn)［13］：力竭性運(yùn)動可導(dǎo)致紅細(xì)胞MDA含量升高、紅細(xì)胞膜Na+,K+-ATPase活性顯著降低，紅細(xì)胞變形能力下降；而有訓(xùn)練的運(yùn)動員，其細(xì)胞膜Na+,K+-ATPase活性在運(yùn)動后顯著升高。孫湄等［14］報(bào)道青少年進(jìn)行次極限強(qiáng)度運(yùn)動后紅細(xì)胞膜Ca2+-ATPase活性下降，ATP供應(yīng)不足可能是酶活性下降的重要因素之一。

表2結(jié)果顯示，訓(xùn)練組大鼠在力竭運(yùn)動后，紅細(xì)胞膜Na+,K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性顯著下降，說明長時(shí)間大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練使大鼠紅細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度加強(qiáng)。其機(jī)制可能是運(yùn)動過程中產(chǎn)生了大量自由基，紅細(xì)胞發(fā)生了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抗氧化酶本身作為一種蛋白質(zhì)也會受到自由基的攻擊而活性下降。而訓(xùn)練服藥組大鼠紅細(xì)胞膜ATPase活性顯著高于訓(xùn)練組，說明葛根總黃酮能顯著提高紅細(xì)胞膜Na+,K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase的活性，在一定程度上提高了紅細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)K+、Na+、Ca2+、Mg2+的能力。其機(jī)制可能與葛根總黃酮可以終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，防止細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸以及膜內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等的自由基損傷，進(jìn)而保護(hù)了運(yùn)動中紅細(xì)胞膜上ATPase的活性，有利于維持運(yùn)動中紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性。

4小結(jié)

1) 葛根總黃酮可以保護(hù)長時(shí)間大強(qiáng)度耐力運(yùn)動中紅細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）的活性，提高抗氧化物質(zhì)GSH的含量，從而降低了脂質(zhì)過產(chǎn)物MDA的生成，說明葛根總黃酮對大強(qiáng)度運(yùn)動過程中紅細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過量自由基具有較強(qiáng)的清除作用，改善了運(yùn)動中紅細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，這對保護(hù)運(yùn)動中紅細(xì)胞內(nèi)Hb的氧化還原狀態(tài)，保證紅細(xì)胞的攜氧能力。

2) 葛根總黃酮可以保護(hù)長時(shí)間大強(qiáng)度耐力運(yùn)動中紅細(xì)胞膜Na+,K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase的活性，說明葛根總黃酮對對維持運(yùn)動中紅細(xì)胞內(nèi)外的離子濃度梯度，保證紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性。

3) 體外試驗(yàn)表明，葛根總黃酮可以抑制H2O2引起的紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象的發(fā)生，那么葛根總黃酮是否可以減輕長時(shí)間運(yùn)動引起的溶血現(xiàn)象？對運(yùn)動性貧血的發(fā)生又有何指導(dǎo)意義？所以葛根總黃酮作為抗疲勞運(yùn)動補(bǔ)劑還需要進(jìn)行深入開發(fā)和利用。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 郭建平,孫其榮,周全,等.葛根總黃酮不同提取工藝的探討［J］.中草藥,1995,26(10):522-524.

［2］ 方允中,李少杰.自由基與酶基礎(chǔ)理論及其在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用［M］.北京:科學(xué)出版社,1994,67-71.

［3］ 劉莉華,宛曉春,李大祥. 黃酮類化合物抗氧化活性構(gòu)效關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,29(3):265-270.

［4］ 張紅雨.黃酮類抗氧化劑結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系的理論解釋［J］.中國科學(xué)（B輯）,1999,29(1):91-96.

［5］ Keller GA, Barke R, Harty JT, et al. Decreased hepatic glutathione levels in septic shock. Predisposition of hepatocytes to oxidative stress: an experimental approach. Arch Surg, 1985,120: (8):941-945.

［6］ Kretzschmar M, Muller D, Hubscher J, et al .Influence of aging, training and acute physical exercise on plasma glutathione and lipid peroxides in man .Int J Sport Med,1991,12(2):218-222.

［7］ 孫存普,張建中,段紹瑾主編.自由基生物學(xué)導(dǎo)論［M］.北京:中國科學(xué)技術(shù)出版社,1999,112-148.

［8］ Witt EH, Reznick AZ, Viguie CA, et al .Exercise, oxidative damage and effects of antioxidant manipulation. J Nutr,1992,122(3 suppl):766-773.

［9］ 蔣風(fēng)萍,周木宏,劉剛,等.葛根素對紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷的防護(hù)作用［J］.中藥藥理與臨床，2004,20(5):11-13.

［10］ 李磊,馮美云,張纓,等. 抗疲勞中藥和跑臺訓(xùn)練對大鼠紅細(xì)胞抗氧化酶和Na+,K+-ATP酶活性的影響［J］.北京體育大學(xué)學(xué)報(bào),2000,23 (3): 326-329.

［11］ Anderson JP, Morrow JS. The interaction of calmodulin with human erythrocyte spectrin. Inhibition of protein 4.1-stimulated actin binding［J］. J Biol Chem,1987, 262(13):6365-6372.

［12］ Hespel P, Lijnen P, Fiocchi R, et al. Erythrocyte cations and Na+,K+-ATPase pump activity in athletes and sedentary subjects ［J］. Eur J Appl Physiol Occup Physiol, 1986,55(1):24-29.

［13］ 衣雪潔. 力竭運(yùn)動對大鼠紅細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平和Na+,K+-ATP酶活性的影響［J］. 沈陽體育學(xué)院學(xué)報(bào),1999,1:15-17.

［14］ 孫湄,高慶生. 運(yùn)動對紅細(xì)胞膜影響的研究-Na+,K+-ATP酶活性在運(yùn)動中的變化［J］. 中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志,1987,6(3):138-141.

“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文”