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    p53基因突變對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞Connexin 45蛋白表達(dá)影響

    2024-10-17 00:00:00劉欣然郇雪潔杜希恂陳曦焦倩姜宏
    青島大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版) 2024年4期

    [摘要]目的探究p53基因突變對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞連接蛋白45(Connexin 45)表達(dá)的影響。方法培養(yǎng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87細(xì)胞(p53野生型)和U251細(xì)胞(p53突變型),用免疫印跡法檢測(cè)兩種細(xì)胞P53和Connexin 45蛋白的表達(dá)。結(jié)果與U87細(xì)胞相比,U251細(xì)胞中P53蛋白和Connexin 45蛋白的表達(dá)均明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.054、4.199,P<0.05)。結(jié)論p53突變可能會(huì)引起膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞Connexin 45蛋白的表達(dá)降低。

    [關(guān)鍵詞]基因,p53;突變;膠質(zhì)母細(xì)胞瘤;細(xì)胞;連接蛋白45

    [中圖分類號(hào)]R394.2;R730.264

    [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

    [文章編號(hào)]2096-5532(2024)04-0475-03doi:10.11712/jms.2096-5532.2024.60.049

    [開(kāi)放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識(shí)碼(OSID)]

    [網(wǎng)絡(luò)出版]https://link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240424.1324.006;2024-04-2514:41:01

    Effect of p53 gene mutation on the protein expression of Connexin 45 in glioblastoma cellsLIU Xinran, HUAN Xuejie, DU Xi-xun, CHEN Xi, JIAO Qian, JIANG Hong

    (State Key Disciplins: Physiology (Incubation), Department of Physiology, Qing-

    dao University, Qingdao 266071, China); [Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of p53 gene mutation on the protein expression of Connexin 45 in glioblastoma cells. MethodsGlioblastoma U87 cells (wild-type p53 gene) and U251 cells (mutant p53 gene) were cultured, and then Western blotting was used to measure the protein expression levels of P53 and Connexin 45.ResultsCompared widf8b2a9c11d95f0b1541da0feaaf36e3dbc39a30ecaec66b6713542138c902fcth U87 cells, U251 cells showed significant reductions in the protein expression levels of P53 and Connexin 45 (t=6.054,4.199;P<0.05). ConclusionThe p53 gene mutation may reducethe protein expression level of Connexin 45 in glioblastoma cells.

    [Key words]genes, p53; mutation; glioblastoma; cells; Connexin 45

    膠質(zhì)瘤是人顱腦最常見(jiàn)且最具侵襲性的一種原發(fā)性腫瘤。近年來(lái)隨著手術(shù)、放療和化療等治療手段不斷進(jìn)步,其治療效果有所改善,但臨床研究顯示腦膠質(zhì)瘤病人確診后中位生存期仍然只有1年[1]。P53作為一種關(guān)鍵的腫瘤抑制因子,在人類腫瘤中極易發(fā)生突變。越來(lái)越多的研究證據(jù)表明,惡性腫瘤和不良預(yù)后常與突變的p53高度相關(guān)[2]。縫隙連接是一種由連接蛋白組成的特殊的蛋白質(zhì)通道,允許離子和小分子在細(xì)胞間直接轉(zhuǎn)移,為細(xì)胞間直接提供信息交換的通道[3]。研究發(fā)現(xiàn),連接蛋白在非病理性遷移過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,可以參與癌細(xì)胞的遷移和侵襲的調(diào)控[4]。其中,連接蛋白45(Connexin 45)是一種縫隙連接蛋白,其編碼基因?qū)俚诙愐职┗?,RNA印跡顯示Connexin 45在許多細(xì)胞系中均可表達(dá)[5]。既往研究表明,Connexin 45表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)[6]。然而,關(guān)于p53突變?cè)谀z質(zhì)母細(xì)胞瘤中對(duì)Connexin 45的調(diào)節(jié)作用的研究目前尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)p53野生型U87細(xì)胞與p53突變型U251細(xì)胞Connexin 45的表達(dá),旨在研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞p53基因突變對(duì)Connexin 45表達(dá)的影響。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

    1材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1細(xì)胞及其來(lái)源實(shí)驗(yàn)所用人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞(p53野生型)和U251細(xì)胞(p53突變型),購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

    1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑DMEM高糖培養(yǎng)液(以色列BI公司),胎牛血清(美國(guó)Gibco公司),青霉素-鏈霉素混合液(100×,北京索萊寶科技有限公司),P53和Connexin 45抗體(美國(guó)Santa Cruz Biotech-nology),GAPDH抗體和羊抗兔IgG-HRP(武漢愛(ài)博泰克(ABclonal)生物科技有限公司)。

    1.2實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將U87細(xì)胞和U251細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)復(fù)蘇后,加入高糖DMEM培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)0.01青霉素-鏈霉素合劑和體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清)并置于二氧化碳無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到80%~90%融合時(shí),使用PBS清洗細(xì)胞加入胰蛋白酶消化后收集于15 mL離心管中,以1 000 r/min離心5 min。用吸管將上清吸除,向離心管中加入新的完全培養(yǎng)液,用吸管輕輕吹打成均勻的單細(xì)胞懸液,接種于新的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

    1.2.2免疫印跡法檢測(cè)P53和Connexin 45蛋白表達(dá)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87和U251細(xì)胞接種于6孔板,培養(yǎng)24 h后用PBS洗滌,加入含有10 g/L磷酸酶抑制劑和20 g/L蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液。冰上充分裂解20 min,提取總蛋白,蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。上樣后首先進(jìn)行恒電壓80 V電泳30 min,然后采用120 V電壓電泳1 h,恒電流300 mA轉(zhuǎn)膜90 min。將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜后,以100 g/L的脫脂奶粉室溫封閉90 min。根據(jù)所需的目的蛋白分子量對(duì)PVDF膜進(jìn)行剪裁,加入GAPDH(1∶10 000)、P53和Connexin 45(1∶1 000)一抗于4 ℃搖床過(guò)夜。次日,孵育完成后,用TBST搖洗3次,每次10 min。加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)耦聯(lián)的山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h。最后加入ECL超敏發(fā)光液(將其試劑盒中的A液與B液1∶1混合)孵育30 s,采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃描密度測(cè)定法進(jìn)行分析。使用Image J軟件分析GAPDH以及P53、Connexin 45的條帶灰度值。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    應(yīng)用Prism Graph Pad 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示,兩組均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1U87與U251細(xì)胞P53蛋白表達(dá)比較

    免疫印跡檢測(cè)的結(jié)果顯示,P53蛋白在U87和U251細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量分別為1.067±0.115和0.301±0.053(n=6)。與U87細(xì)胞相比較,P53蛋白在U251細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.054,P<0.001)。見(jiàn)圖1。

    2.2U87與U251細(xì)胞Connexin 45蛋白表達(dá)比較

    免疫印跡檢測(cè)結(jié)果表明,Connexin 45蛋白在U87和U251細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量分別為0.842±0.079和0.405±0.068(n=6)。與U87細(xì)胞相比較,Connexin 45蛋白在U251細(xì)胞的表達(dá)顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.199,P<0.01)。見(jiàn)圖2。

    3討論

    成年人中最常見(jiàn)的惡性原發(fā)性顱腦腫瘤為膠質(zhì)瘤。其中,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最易復(fù)發(fā)的惡性實(shí)體腫瘤之一,約占所有膠質(zhì)瘤的57%,約占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的48%,且病人中位生存期不足2年[7]。P53是一種腫瘤抑制因子,在應(yīng)激時(shí)被激活,通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡來(lái)阻止受損細(xì)胞的增殖和維持基因組的穩(wěn)定性。P53通路的變化被認(rèn)為是導(dǎo)致低級(jí)別膠質(zhì)瘤發(fā)展為高級(jí)別膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵因素,在繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中觀察到p53的突變顯著增加[8]。p53基因突變與許多癌癥有關(guān),在腫瘤細(xì)胞中,p53基因的突變最常發(fā)生在其DNA結(jié)合域的第102~292位氨基酸殘基之間,其中約10%為功能喪失突變,造成P53蛋白的功能喪失及改變[9]。U251細(xì)胞存在p53基因的錯(cuò)義點(diǎn)突變,其突變位點(diǎn)為R273H,造成P53蛋白含量明顯降低[10]。有研究發(fā)現(xiàn),p53突變的細(xì)胞可以誘導(dǎo)致癌小分子RNA的表達(dá),引起高爾基體的囊泡形成,增強(qiáng)囊泡的運(yùn)輸和分泌,從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[11]。此外,p53突變可以增強(qiáng)癌細(xì)胞的Warburg效應(yīng),增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖能力[12]。

    縫隙連接具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化,維持組織穩(wěn)態(tài)的生理功能。連接蛋白在腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。研究已發(fā)現(xiàn),在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,通過(guò)改變連接蛋白的表達(dá),顯著增強(qiáng)了膠質(zhì)瘤

    細(xì)胞的侵襲性[13]。有研究表明,Connexin 45在原發(fā)性結(jié)直腸癌組織高度甲基化,而在正常結(jié)直腸黏膜中則未甲基化,這表明Connexin 45表達(dá)的降低或缺失可能發(fā)生在腫瘤早期階段,參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。研究顯示,在高葡萄糖刺激下,Conne-

    xin 45可顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[15]。此外,有研究顯示連接蛋白表達(dá)的下調(diào)可通過(guò)P53依賴的途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移[16]。既往研究發(fā)現(xiàn),U251細(xì)胞比U87細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力[17]。還有研究顯示,在胰腺癌細(xì)胞中,突變的P53蛋白通過(guò)與P62蛋白相互作用,加速細(xì)胞連接蛋白的降解,從而增加癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的概率[18]。此外,在非小細(xì)胞肺癌中,低氧激活MDM2-P53通路,刺激連接蛋白泛素化,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移[19]。因此,我們猜測(cè)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中,P53通過(guò)改變Connexin 45的表達(dá)可能會(huì)成為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲過(guò)程中一個(gè)至關(guān)重要的因素。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,U251細(xì)胞中Connexin 45的表達(dá)水平顯著低于U87細(xì)胞,表明膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中Connexin 45蛋白的表達(dá)降低可能與p53突變有關(guān)。因此,闡明突變的p53對(duì)Connexin 45表達(dá)的調(diào)節(jié)作用以及促進(jìn)膠質(zhì)瘤發(fā)展的機(jī)制,對(duì)靶向膠質(zhì)瘤提供新的治療思路具有重要意義。

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    (本文編輯于國(guó)藝)

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