響應面法優(yōu)化山毛豆抑菌物質(zhì)提取條件的研究

胡林子 李新華 馬永全 于 新

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院1，沈陽 110161)

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院2，廣州 510225)

響應面法優(yōu)化山毛豆抑菌物質(zhì)提取條件的研究

胡林子1，2李新華1馬永全2于 新2

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院1，沈陽 110161)

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院2，廣州 510225)

以山毛豆種子為試驗材料，對水浴浸提法提取山毛豆種子中抑菌物質(zhì)的工藝進行研究，研究溫度、提取時間、提取溶劑、提取pH對山毛豆種子中抑菌物質(zhì)提取效果的影響。在單因素試驗基礎上，利用響應面分析法(RSM)優(yōu)化山毛豆抑菌物質(zhì)的提取條件。得到山毛豆抑菌活性物質(zhì)的最佳提取工藝條件為:溫度64℃，提取時間11 h、體積分數(shù)52%乙醇為溶劑，溶劑pH 6。該條件下體積分數(shù)為20%的山毛豆提取液對3種供試菌的抑菌圈直徑均值為18．34 mm，與理論最優(yōu)值18．42 mm接近。

山毛豆種子 提取 抑菌活性 響應面法

非洲山毛豆(Tephrosia vogelii Hook f．)又稱福氏灰毛豆、窩氏灰葉，屬豆科，蝶形花亞科，灰葉屬，多年生灌木，是一種優(yōu)良的水土保持、荒坡綠化、土壤改良植物［1－3］。非洲山毛豆種子含有粗脂肪13．47%，其中，不飽和脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)為66．94%，粗蛋白質(zhì)量分數(shù)為38．73%，是潛在的食品與飼料優(yōu)質(zhì)資源［4－5］。非洲山毛豆含有魚藤酮類化合物，是一種優(yōu)良的殺蟲植物，其殺蟲活性的發(fā)現(xiàn)、研究和應用在國內(nèi)外已有70多年歷史［6］，前人研究了非洲山毛豆葉、莖提取魚藤酮類物質(zhì)作為生物殺蟲劑使用，效果良好，但是對于山毛豆種子、葉莖提取物的抑菌作用的研究鮮見研究報道。本試驗用響應面分析法(RSM Response Surface Methodology)優(yōu)化提取非洲山毛豆種子的抑菌活性物質(zhì)的工藝條件，旨在為山毛豆資源的利用及天然抑菌劑的開發(fā)提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

山毛豆種子:采自廣州市花都區(qū)北興鎮(zhèn)山坡(北緯 23°27＇，東經(jīng) 113°26＇);大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus):華南農(nóng)業(yè)大學食品微生物實驗室;乙型副傷寒沙門氏菌(Salmo-nella paratyphi B．CMCC50094)，廣東省微生物研究所。培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1．2 試劑及儀器

無水乙醇、NaOH:天津市河東區(qū)紅巖試劑廠;瓊脂:廣州市紫興化玻;Na2HPO4;NaH2PO4;NaCl(均為分析純);牛肉膏(生化試劑)、蛋白胨(生化試劑):天津市河東區(qū)紅巖試劑廠。

MJ－176NR型多功能粉碎機:日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社;DHG－9140A型電熱恒溫干燥箱:廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;R系列旋轉薄膜蒸發(fā)儀:無錫星海生化設備有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海索普儀器有限公司;SW－CJ－IF型無菌超凈工作臺:蘇州凈化設備有限公司;KQ5200型超聲波清洗器:廈門中村光學儀器廠。

1．3 試驗方法

1．3．1 提取物的制備

山毛豆粉碎過100目篩。取3份100 g于燒杯中，以料液比1∶10加入提取劑，恒溫水浴浸提，四層紗布過濾，真空抽濾，旋轉薄膜蒸發(fā)儀在60℃減壓濃縮，得黑紅色黏稠物10 mL。0～4℃冷存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．2 試驗方案

以不同溫度、提取時間、提取劑濃度、溶劑pH為因素，以抑菌圈直徑為指標，根據(jù)單因素確定顯著水平，在此基礎上，采用Design Expert7．0統(tǒng)計分析軟件的響應面分析法設計試驗，以獲取最適工藝參數(shù)［7］。

1．3．3 抑菌效力的測定

1．3．3．1 菌懸液制備

在無菌條件下，將供試菌種接種到牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，挑取菌落，用無菌生理鹽水稀釋，獲得 1．0×106～1．0×107CFU/mL的菌懸液，備用［8］。

1．3．3．2 提取物抑菌作用的測定

用無菌水將山毛豆提取物稀釋至20%(體積分數(shù))。采用管碟法［9］，取無菌培養(yǎng)皿(直徑90 mm、高18 mm)，每皿加入2%的瓊脂作底層。在培養(yǎng)基內(nèi)等距離分散放置兩個牛津杯(內(nèi)徑6 mm，外徑8 mm，高10 mm)，將菌懸液加入到溫度適宜的培養(yǎng)基中，混勻后迅速倒入培養(yǎng)皿，每皿約到培養(yǎng)基15 mL，靜置20 min后待培養(yǎng)基凝固取出牛津杯，分別移取樣品溶液150 μL加入到平板杯孔中，每個菌種每種提取物做4組平行，以無菌水空白對照。37℃培養(yǎng)12 h，測量抑菌圈直徑，取平均值，記錄結果。

2 結果與分析

2．1 單因素試驗

2．1．1 溫度對提取效果的影響

以50%乙醇為溶劑，調(diào)節(jié)pH為7，分別在40，50，60，70，80 ℃溫度下浸提 10 h，結果見圖 1。提取溫度介于40～60℃時，山毛豆提取物抑菌作用隨提取溫度的升高呈增強趨勢;當提取溫度大于60℃時，抑菌作用沒有顯著變化。因此，較佳的提取溫度約為60℃。

圖1 不同溫度提取物的抑菌效果

2．1．2 時間對提取效果的影響

在提取劑為體積分數(shù)50%乙醇，pH為7，溫度60 ℃的條件下，分別浸提4，6，8，10，12，14 h，提取液抑菌結果如圖2。

山毛豆提取物的抑菌效果隨著提取時間的延長呈先增強后持平的趨勢，這主要是由于開始時原料和溶劑之間的濃度差比較大，擴散速度快，有效抑菌成分浸出速度也快，但隨著時間延長，非抑菌成分的溶出，造成了山毛豆提取物抑菌效果的下降。因此，10 h為較佳浸提時間。

圖2 提取時間對提取物抑菌效果的影響

2．1．3 乙醇體積分數(shù)對提取效果的影響

在60℃的條件下，乙醇溶劑體積分數(shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%，調(diào)節(jié) pH 為 7，對原料浸提10 h。提取物抑菌效果見圖3。

圖3 乙醇體積分數(shù)對提取物抑菌效果的影響

在其他條件相同的情況下，當乙醇體積分數(shù)在30%～50%范圍內(nèi)，山毛豆提取物的抑菌效果隨乙醇體積分數(shù)的增加而明顯增強。當乙醇體積分數(shù)＞50%時，抑菌效果隨體積分數(shù)的增加而顯著減弱。這可能是由于當乙醇體積分數(shù)增加到一定值時，溶劑與抑菌物質(zhì)極性差別增大，同時山毛豆種子中一些醇溶性雜質(zhì)溶解量增大，與抑菌活性物質(zhì)競爭同乙醇－水分子結合，造成抑菌物質(zhì)溶解度減小。因此，選取提取劑乙醇體積分數(shù)在50%左右為適宜。

2．1．4 溶劑pH對提取效果的影響

在提取劑為50%乙醇，調(diào)節(jié)pH分別為4、5、6、7、8，在60℃的條件下，浸提10 h，提取液抑菌結果如圖4。

當溶劑pH 5～pH 7時，山毛豆提取液呈現(xiàn)較好的抑菌效果。為上述3個自變量的編碼值。

對模型進行方差分析(表3)、模型系數(shù)顯著性檢驗(表4)。

圖4 溶劑pH對提取物抑菌效果的影響

2．2 響應面法優(yōu)化試驗

2．2．1 試驗設計及模型分析

依據(jù) Design Expert7．0 軟件(Static Made Easy，Minneapolis，MN，USA．version)，采用 Central Composite Design 建立數(shù)學模型［10］，固定溶劑 pH 6．0，以提取溫度(X1)、浸提時間(X2)、乙醇體積分數(shù)(X3)值為自變量，以+1、0、－1分別代表自變量的高、中、低水平，按方程xi=(Xi－X0)/ΔX對自變量進行編碼。其中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，X0為試驗中心點處自變量的真實值，ΔX為自變量的變化步長，因子編碼及水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表

以3種供試菌為研究對象，測定抑菌圈直徑，重復3次，取平均值為響應值(Y)，測定結果見表2。

依據(jù) Design Expert 7．0軟件中的 Central Composite Design方法，以浸提溫度、浸提時間、乙醇體積分數(shù)為因素設計響應面試驗，對試驗設計中各組提取物的抑菌效果進行回歸分析，得回歸方程為:

式中:Y為抑菌圈平均值的預測值;x1～x3分別

表2 響應面試驗設計及試驗結果

表3 回歸模型方差分析表

從該方程的方差分析(表3)可知，本試驗所選模型不同處理間差異極顯著(P＜0．000 1)，說明回歸方程應變量與全體自變量之間的相關關系是顯著的，即這種試驗方法可靠;失擬項 P=0．184 4＞0．05，失擬項差異不顯著，表明該方程對試驗擬合情況好，試驗誤差小，可以用該方程對不同提取條件下的抑菌效果進行預測。試驗中，變異系數(shù)較低(0．55%)，說明了試驗可靠性強;模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0．994 8，說明回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系。該模型的信噪比(S/N)為52．997，遠大于4，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，能夠很好地對提取物的抑菌效力進行預測。

表4 回歸方程模型系數(shù)的顯著性檢驗

由表 4 可知，模型一次項 x2，x3，x1(P ＜0．000 1)差異極顯著;二次項x12、x22、x32(P ＜0．000 1)差異極顯著;交互項x1x2(P＜0．000 1)差異極顯著，x1x3(P=0．320 0)差異不顯著，x2x3(P=0．003 3)差異極顯著。x1、x2、x3對山毛豆提取物抑菌效果影響因素主次順序為:溫度＞時間＞乙醇體積分數(shù)。

2．2．2 響應面分析與優(yōu)化

模型的響應面圖解結果見圖5～圖7。各圖表示X1、X2、X3中任意一個變量取零水平時，其余兩個變量對提取物抑菌能力的影響［11－12］。從圖5～圖7中可知，時間和乙醇體積分數(shù)的交互作用相對其他因素之間的交互作用最大，而溫度和時間之間的交互作用最小。

用Design－Expert軟件對試驗模型進行典型性分析，以獲得優(yōu)化的提取條件。經(jīng)分析，X1、X2、X3最適值分別為:64．19 ℃，11．21 h，52．06%，理論平均抑菌圈直徑為18．42 mm。

圖5 溫度、時間因素的交互作用對提取物抑菌效力的影響

2．3 優(yōu)化條件的驗證

將提取條件修正為溫度64℃，提取時間11 h、乙醇體積分數(shù)52%，溶劑pH 6．0，以驗證響應面法優(yōu)化條件的可靠性。在優(yōu)化條件下，重復試驗5次，取平均值。試驗測得大腸桿菌的平均抑菌圈直徑為14．71 mm，金黃色葡萄球菌的平均抑菌圈直徑為20．13 mm，沙門氏菌的平均抑菌圈直徑為20．18 mm，3種供試菌的抑菌圈直徑均值為18．34 mm，與理論最優(yōu)值(18．42 mm)僅相差0．45%。證明該模型具有一定的可靠性。

3 結論

通過提取溫度、提取時間、乙醇體積分數(shù)及其pH值的單因素試驗和響應面分析的各因素交互試驗，對山毛豆種子抑菌活性物質(zhì)的提取條件進行優(yōu)化。獲得優(yōu)化提取條件為:溫度64℃，提取時間11 h、溶劑乙醇的體積分數(shù)52%，溶劑pH 6．0。該條件下的山毛豆提取液對3種供試菌的抑菌圈直徑均值為18．34 mm，與理論最優(yōu)值十分接近。由此可見，通過響應面分析法優(yōu)化的波提取山毛豆種子抑菌物質(zhì)的工藝條件在實踐上是可靠的。

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Optimizing Extraction Conditions of Antimicrobial Substance from Tephrosia vogelii Hook f．Seeds by Response Surface Methodology

Hu Linzi2Li Xinhua1Ma Yongquan2Yu Xin2

(College of Food Science，Shenyang Agricultural University1，Shenyang 110161)
(College of Light Industry and Food Science，Zhongkai University of Agriculture and Engineering2，Guangzhou 510225)

The antimicrobial components of Tephrosia vogelii Hook f．seeds were extracted by the water－ bath method．The conditions such as extraction temperature，time，ethanol concentration and pH for the extraction have been researched．On the basis of single factor tests，the extraction conditions were optimized with the response surface methodology．Results:The optimum conditions for the extraction are temperature 64 ℃，extraction time 11 h，using ethanol of volume concentration of 52%as solvent，and pH of 6．With these extraction conditions，the extract at a volume concentration of 20%exhibits an average value of microbe inhibition zone of 18．34 mm，close to the theoretically predicted value of 18．42 mm．

Tephrosia vogelii Hook f．Seeds，extraction，antimicrobial activity，response surface methodology

TS201．3

A

1003－0174(2011)03－0095－05

廣東省科技計劃(2008B030302001)

2010－03－01

胡林子，女，1985年出生，碩士，糧食油脂及植物蛋白工程

于新，男，1959年出生，教授，農(nóng)產(chǎn)品加工與儲藏