基于免疫組化和癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)分析SOD1在宮頸癌中的表達

林冰潔,王齊心,聶曉菁,2,張孜睿卓,史永華,2

(1.新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學教研室,新疆 烏魯木齊 830017;2.新疆醫(yī)科大學新疆地方病分子生物學重點實驗室,新疆 烏魯木齊 830017)

宮頸癌(cervical cancer,CC)是威脅女性死亡的主要原因之一,2020年全球約有60萬例新發(fā)病例和34萬例死亡[1],是僅次于乳腺癌、結直腸癌、肺癌的第四常見腫瘤[2]。中國是宮頸癌發(fā)病率和死亡率最高的國家之一[3]。宮頸癌的一個重要臨床病理特點是常伴有慢性炎癥。微環(huán)境中持續(xù)存在的炎性刺激和缺氧致使活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)顯著增多,局部代謝異常。為抵抗過量的ROS,癌細胞內的抗氧化系統(tǒng)也相應增強,此時抗氧化途徑的激活被認為是癌癥發(fā)生過程的一個關鍵事件[4]。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutases,SOD)是一種催化超氧化物自由基脫位為過氧化氫和分子氧的抗氧化酶。SOD1(Cu/Zn-SOD)作為其中的一種異構體,主要分布在細胞內,是一種內源性蛋白[5]。SOD1作為一種抗氧化劑,除與衰老相關的氧化應激有關外[6],還在調節(jié)細胞、保護基因組DNA穩(wěn)定方面發(fā)揮重要的作用[7]。由于SOD1能夠清除自由基,通常被認為其具有抑癌作用。深入研究發(fā)現(xiàn),隨著癌細胞內的ROS濃度升高,其引起的氧化應激反應隨之上調,在肺腫瘤、乳腺腫瘤和鼻咽癌中均觀察到SOD1表達升高[8-11]。本次研究旨在探討SOD1在宮頸癌中的表達及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院2016年11月至2019年8月手術切除標本共150例,包括宮頸鱗癌、宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN) II-III和正常宮頸組織各50例。納入標準:宮頸鱗癌均經病理確診;無嚴重并發(fā)癥;有完整的病理資料。所有研究對象均知情同意自愿參與研究。收集標本相關的臨床病理信息,包括年齡、臨床分期、腫瘤直徑、病理分級、浸潤深度、淋巴結轉移等。臨床分期根據(jù)國際婦產科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)的標準確定。

1.2 免疫組化

應用免疫組化(immunohistochemistry,IHC)檢測SOD1在宮頸組織中的表達。按照免疫組化的常規(guī)操作進行,即準備好2μm厚的石蠟宮頸組織切片,脫蠟水化,抗原修復后滴加抗SOD1兔單克隆抗體(Priteintech,22206-1-AP) 4℃過夜,然后二抗室溫孵育(羊抗兔IgG,中國北京中杉金橋公司)30分鐘,3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(3,3N-Diaminobenzidine,DAB)顯色,蘇木素復染,脫水,透明,封片。SOD1染色由兩名新疆醫(yī)科大學病理教研室的專家審閱評價。SOD1結果用Image Pro Plus6.0軟件進行量化分析。

1.3 TCGA數(shù)據(jù)庫分析

本研究借助R2生物信息平臺(http://hgser-ver1.amc.nl/cgi-bin/R2/main.cgi)對TCGA-305-rsem-tcgars數(shù)據(jù)集宮頸鱗癌組織樣本中SOD1 mRNA的表達進行了數(shù)據(jù)挖掘,并分析KIM數(shù)據(jù)庫中300例宮頸癌(包括宮頸鱗癌、腺癌和腺鱗癌)樣本中SOD1 mRNA的表達水平與組織學類型的關系。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料用例數(shù)(n)和百分比(%)表示,組間比較采用卡方檢驗或方差分析。Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗分析SOD1表達與生存的關系。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SOD1在宮頸組織中的定位和表達

免疫組化結果顯示,50例宮頸鱗癌中,38例(76%)SOD1表達陽性;50例CIN中,26例(52%)SOD1表達陽性;50例正常組織中,16例(32%)SOD1表達陽性。SOD1在宮頸鱗癌中表達最高、CIN次之、正常組織中最低,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=19.50,P<0.05)。正常宮頸組織中SOD1均在胞漿中表達;CIN組織中,單純胞漿表達12例,單純胞核表達8例,胞漿和胞核均表達6例;宮頸鱗癌組織中,單純胞漿表達7例,單純胞核表達23例,胞漿和胞核均表達8例,見圖1。在正常宮頸組織、CIN與宮頸鱗癌組織中,隨著宮頸病變級別的升高,SOD1胞核陽性表達率逐漸升高,其差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=6.850,P<0.05)。

注:(a)宮頸鱗癌組織中SOD1的胞核表達;(b)宮頸鱗癌組織中SOD1的胞漿表達;(c)宮頸鱗癌組織中SOD1的胞核和胞漿共表達;(d)CIN組織中SOD1的胞核表達;(e)CIN組織中SOD1的胞漿表達;(f)正常宮頸組織中SOD1在基底細胞的表達(SP×200)。

2.2 宮頸鱗癌組織SOD1表達與臨床病理參數(shù)的關系

在宮頸鱗癌中,SOD1的表達與組織浸潤有關,其陽性表達組的宮頸癌浸潤深度明顯高于陰性表達組,差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=10.424,P=0.001);SOD1的表達與病理學分級、腫瘤大小、淋巴結轉移和臨床分期均無關(P>0.05),見表1。

表1 宮頸鱗癌組織SOD1表達與臨床病理參數(shù)的關系 [n(%)]

2.3 R2生物信息平臺中SOD1表達分析

借助R2生物信息平臺對TCGA-305-rsem-tcgars數(shù)據(jù)集宮頸鱗癌組織樣本中SOD1 mRNA的表達進行了數(shù)據(jù)挖掘和分析,結果顯示,SOD1 mRNA在宮頸癌所有臨床分期中均表達,見圖2。Kaplan-Meier生存分析提示,SOD1高表達組患者(120例)較SOD1低表達組(172例)具有更好的預后(χ2=5.18,P=0.023),見圖3。對KIM-300-custom-ilmnht12v4數(shù)據(jù)集中宮頸癌組織樣本SOD1 mRNA的表達情況進行分析,結果顯示,SOD1在不同組織學類型宮頸癌中的表達差異具有統(tǒng)計學意義(F=4.84,P=0.009),見圖4。

圖2 SOD1 mRNA在305例宮頸鱗癌中的表達

圖3 292例宮頸鱗癌中SOD1表達與生存的關系

圖4 300例宮頸癌中SOD1表達與組織學類型的關系

3 討論

3.1 病理狀態(tài)下SOD異常表達的生物學意義

SOD作為抗氧化系統(tǒng)的重要代表,其表達升高是慢性炎癥持續(xù)刺激的必然結果。慢性炎癥導致單核巨噬細胞系統(tǒng)的激活,產生高水平的ROS[12],ROS水平急劇增加至有毒濃度,氧化應激將造成不可逆的損傷[13]。此時,為抵抗過量的ROS,體內的抗氧化酶SOD表達上升。氧化應激和慢性炎癥過程是緊密耦合的,如果不能阻止這些過程,可能會導致驅動癌變[14]。眾所周知,宮頸癌與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)持續(xù)感染密切相關,是慢性炎癥相關癌癥的典型代表。與正常細胞相比,癌細胞通常含有更高水平的ROS和抗氧化酶,特別是在晚期,癌細胞非常依賴高活性的抗氧化系統(tǒng)來維持快速增殖和存活[15]。人體中有三種SOD同工酶:SOD1提供了80%的總細胞SOD活性[16],在調節(jié)氧化應激反應中作為轉錄因子,可防止細胞過度損傷和凋亡[17];SOD2在不同類型的腫瘤中具有致癌和抑癌的雙向作用[18];SOD3作為主要的ROS防御因子,在對胰腺導管癌的研究中發(fā)現(xiàn)其表達量降低與不良預后密切相關[19]。

本研究中,我們借助R2生物信息平臺對TCGA-305-rsem-tcgars數(shù)據(jù)集305例宮頸鱗癌組織樣本中的SOD1 mRNA表達進行了數(shù)據(jù)挖掘和分析,結果顯示,SOD1高表達組患者的預后較好。同時對KIM-300-custom-ilmnht12v4數(shù)據(jù)集300例宮頸癌組織樣本中的SOD1 mRNA表達分析提示,SOD1在宮頸腺鱗癌的表達高于其在鱗癌、腺癌中的表達,提示SOD1表達與宮頸癌的不同組織學類型相關?？梢奡OD在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學行為非常復雜,值得深入探討。

3.2 宮頸癌中SOD1表達及其細胞定位的分析和意義

在本研究中,我們檢測并分析了SOD1蛋白在宮頸病變內的表達,結果顯示在正常宮頸組織、癌前病變、宮頸鱗癌中,隨著宮頸病變級別的升高,SOD1的表達逐漸升高。有證據(jù)表明,SOD1是一種致癌基因,在體內促進癌細胞增殖,加速腫瘤發(fā)展,并在人類許多癌癥中過表達。Li[20]等研究顯示,SOD1在鼻咽癌中的表達顯著增加,且高表達患者的生存時間較短。Gomez等[9]研究發(fā)現(xiàn),SOD1對癌基因介導的乳腺癌細胞增殖至關重要,且增殖的特異性與癌細胞中超氧化物的升高相關,但在正常細胞中并沒有觀察到這些。此外,在所有分子亞型的乳腺癌內,SOD1表達升高與較低的生存率和轉移增加密切相關。另有研究發(fā)現(xiàn),SOD1也在多發(fā)性骨髓瘤中表達,其作用發(fā)生在疾病進展的較晚階段,表明SOD1的表達增加提示著不良預后[21]。然而,本研究生物信息學分析表明SOD1高表達組的宮頸癌患者預后較好,與我們的實驗結論及以上文獻報道不一致,對此我們分析如下:生物信息學分析的結果是基于SOD1 mRNA的表達數(shù)據(jù),我們的實驗結果是基于免疫組化SOD1的蛋白表達數(shù)據(jù),SOD1轉錄水平和翻譯水平表達意義的不一致可能反映出SOD1存在翻譯后調控或修飾。酶活性發(fā)揮的整體機制復雜,僅在轉錄或者翻譯水平并不能推斷酶最后的活性,此過程涉及翻譯后修飾,細胞定位及與其他蛋白之間的互作。但這還需要我們進一步研究來佐證[22]。

SOD1作為轉錄因子參與到癌癥進程中[23]。在HeLa細胞中,SOD1已被證明與癌基因和抑癌基因的啟動子結合,通過下調抑癌基因、上調致癌基因促進腫瘤的發(fā)生。此外,SOD1除了抗氧化酶的作用外,還作為一種響應H2O2的調控蛋白,在許多哺乳動物基因的表達中發(fā)揮作用[24]。研究表明在應對高水平H2O2(0.4mM)的氧化應激時,SOD1會轉移到細胞核,從而通過轉錄上調抗氧化基因的表達[17]。文獻報道,核SOD1蛋白表達在多種人體組織中,尤其在睪丸、小腦、乳房、皮膚真皮層中表達豐富[23],并在乳腺癌和肺癌的細胞核中不斷富集[4,9]。這支持了本研究中免疫組化染色實驗結果,SOD1除在正常宮頸組織的胞漿內表達外,還表達于基底細胞胞核內。在正常宮頸組織逐漸進展為宮頸癌的過程中,SOD1在胞漿的表達逐漸減少,而在胞核的表達量逐漸增高。SOD1的表達與宮頸癌臨床病理參數(shù)關系的分析結果顯示,SOD1在胞核的表達與組織浸潤有關。在對KRAS驅動的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的研究中報道,SOD1定位于細胞核,通過與PeBoW蛋白相互作用,在癌細胞增殖中起著重要的作用,并與NSCLC腫瘤的預后相關[4],這與本研究結果一致。

綜上所述,在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展進程中, SOD1的異常表達與宮頸癌的浸潤深度、組織學類型有關,宮頸癌中SOD1胞核表達量的增高對宮頸癌患者的預后具有一定的參考價值,開發(fā)其抑制劑用于聯(lián)合抗腫瘤治療具有潛在的可能性。